偉柳廣昊旭陽韓 英*

（1.北安市農業(yè)開發(fā)辦 黑龍江 北安 164000）

（2.東北農業(yè)大學動物科學技術學院 黑龍江 哈爾濱 150030）

三倍體虹鱒制種技術與倍性鑒定

王偉1柳廣昊2姜旭陽2韓 英2*

（1.北安市農業(yè)開發(fā)辦 黑龍江 北安 164000）

（2.東北農業(yè)大學動物科學技術學院 黑龍江 哈爾濱 150030）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭形目、鮭科，是重要的冷水性養(yǎng)殖魚類，三倍體虹鱒以其不育或育性不良、肉質提升和生長周期縮短等特點得到養(yǎng)殖者的喜愛。盡管國內多地已經(jīng)進行了三倍體虹鱒制種的研究，但效果并不理想，目前三倍體虹鱒苗種主要依靠國外進口。本文擬對三倍體人工誘導和倍性鑒定兩個方面進行總結，以利于更有效地進行三倍體虹鱒規(guī)模制種。

虹鱒；三倍體；人工誘導；制種；倍性鑒定

虹鱒是世界主要的冷水性養(yǎng)殖魚類，在我國已有50多年的養(yǎng)殖歷史。近年來三倍體虹鱒受到養(yǎng)殖者青睞。與二倍體虹鱒相比，三倍體虹鱒體內有三套染色體，其性腺發(fā)育不良，因此生長快，肉質好，個體大，經(jīng)濟價值高。因為三倍體虹鱒雌性不育，不可通過培育親魚來繁殖后代，所以三倍體虹鱒的制種尤為重要。近年來我國北京、黑龍江、甘肅等地都開展了關于三倍體虹鱒制種的研究，但效果并不理想，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。三倍體虹鱒的苗種仍需從美國等國外進口，進口的三倍體虹鱒雖然三倍體率較高，但價格昂貴，運輸不便。下面介紹一下三倍體虹鱒的制備方法和倍性的鑒定方法。

1 三倍體虹鱒的制備

多倍體魚類的產(chǎn)生是由于細胞內的染色體的加倍而形成。魚類精子入卵的時間是在第二次成熟分裂的中期，受精后放出第二極體，如果卵子受精后因為各種因素刺激，導致第二極體不排出，即沒有經(jīng)過減數(shù)分裂形成二倍體卵核，直接與單倍體精核結合得到三倍體受精卵。常見誘導魚類多倍體的方法主要可以分為物理法、化學法和生物學方法。

物理學方法的機制是破壞紡錘絲微管的形成，使應由微管蛋白聚合成的微管解體或阻止微管聚合這一過程，使染色體失去移動的能力，阻止染色體向兩極移動，形成多倍體細胞。主要包括溫度休克法、靜水壓法和電休克法，其中溫度休克法因成本低、操作簡單且無需專業(yè)設備而被廣泛應用。一般冷水性魚類采用熱休克法，而溫水性魚類則采用冷休克法。

化學物質也可以用來阻止第二極體或第一極體的排出而產(chǎn)生三倍體，但目前使用化學法三倍體制種主要集中在貝類，在魚類上研究甚少。主要使用的化學誘導劑有6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）、細胞松弛素B（CB）、咖啡因、聚乙二醇（PEG）和秋水仙素等。

生物學方法包括遠緣雜交、核移植和細胞融合等。遠緣雜交在鯉科魚類應用較多，如吳維新用興國紅鯉和草魚進行遠緣雜交而獲得了四倍體雜種。核移植誘導魚類多倍體仍處于實驗階段，該技術很有可能為誘導四倍體魚類開辟新的篇章。細胞融合是誘導魚類囊胚細胞與囊胚細胞、囊胚細胞與卵細胞、胚囊細胞與受精卵、受精卵與受精卵之間的細胞融合，但由于細胞內染色體組發(fā)生重排，實際得到的魚類細胞群往往是含有不同數(shù)量染色體的，不適合實際生產(chǎn)應用。目前，采用雌核發(fā)育、性別轉換和三倍體生物學誘導相結合，成為培育三倍體全雌魚的新技術。

目前物理方法中的溫度休克法最為常用。Chourrout采用27-30℃的休克溫度在虹鱒受精后70min作用10min，得到了三倍體幼魚。Peter等在制備溪鱒三倍體時采用28℃的休克溫度，在受精完成10min后，持續(xù)處理10min，得到98%-100%的三倍體，相對存活率為42%。Dube在對美洲紅點鮭受精完成15min后，放入26℃的水中，處理時間不超過25min，得到了大量的三倍體幼魚。王炳謙等在水溫6.5℃的條件下，受精后20min，以26.6℃的休克溫度處理虹鱒受精卵20min，也成功得到三倍體虹鱒。不同的實驗條件和結果表明，獲得虹鱒三倍體的最佳條件為：處理溫度26.5℃，處理起始時間為受精后15min，處理持續(xù)時間為10min，其中處理時間為主要的影響因子。

人工誘導三倍體完成后，當胚胎發(fā)育至原腸胚時，計算受精率，方法是隨機抽取20粒卵，放入裝有鑒別液的培養(yǎng)皿中，作用3-5min后，肉眼見到有白色線狀配體的為受精卵，做三次取平均值，按照受精卵所占的比例計算出受精率。鑒別液的配方為：氯化鈉7g，冰醋酸50ml，蒸餾水1L。

發(fā)眼率為人工誘導的受精卵發(fā)育成發(fā)眼卵的數(shù)量與總卵數(shù)的比值。發(fā)眼卵的孵化和苗種培育條件同二倍體虹鱒相同。

2 三倍體虹鱒的倍性鑒別

除采用四倍體與二倍體雜交制種外，其它誘導方法三倍體魚類的誘導率很難達到100%，而且常常表現(xiàn)為嵌合體，因此，鑒定倍性就顯得尤為重要。倍性檢測法分為間接法（包括生化分析、核體積測量、蛋白質電泳等）和直接法（包括DNA含量測定、染色體計數(shù)、核仁數(shù)目銀染法等）。其中常用的為紅細胞體積測量法、流式細胞儀檢測法、染色體計數(shù)法和核仁數(shù)目銀染法：紅細胞體積的測量較為簡單，廣泛應用于多倍體生物的鑒定；流式細胞儀法可以準備、快速的測定DNA含量，但是檢測成本較高，不適合規(guī)模生產(chǎn)上使用；染色體計數(shù)是鑒定多倍體倍性最準確的方法，但是比較費時，大多數(shù)用胚胎制作染色體標本；核仁數(shù)目銀染法是利用細胞的核仁數(shù)目隨染色體組的增加而按比例增加這一原理，來分析胚胎細胞的核仁分布情況，從而鑒定倍性。

紅細胞體積法：采集三倍體虹鱒尾動脈外周血，制成血涂片，每尾魚制10張血涂片，甲醇固定后，Giemas染色，鏡下觀察。在每張片子上隨機選取20個紅細胞，測量其長徑a和短徑b，計算平均值和標準差，根據(jù)公式V=a×b2×1.91-1計算紅細胞體積。測得的三倍體虹鱒血細胞數(shù)據(jù)與二倍體虹鱒血細胞數(shù)據(jù)若與預期理論值（1.5：1）無顯著差異，則證明所測樣本為三倍體，制種成功。

流式細胞儀法：虹鱒尾靜脈取血，用1%的肝素對針頭進行抗凝處理，2000rpm離心10min，去上清，沉淀中加入70%乙醇固定過夜。隔天用PBS進行洗滌，2000rpm下離心5min，洗滌2-3次。用紅細胞計數(shù)板將血細胞計數(shù)，并用生理鹽水將血細胞稀釋至107個/ml。每毫升稀釋過的紅細胞中加入200ul，20ug/ml的RNAse，37℃下孵育30min，冰浴中終止反應。然后加入200ul，40ug/ml的PI，4℃下避光染色15min，上流式細胞儀進行測定。本實驗室前期實驗，隨機檢測100尾誘導的三倍體虹鱒，與二倍體對照組進行比較，結果顯示，檢測的100尾虹鱒中，有75尾DNA含量約為72（對照組二倍體DNA含量約為48），說明三倍體誘導率為75%。

染色體計數(shù)法：取少量原腸期胚胎，放入培養(yǎng)皿中，加入100ppm秋水仙素溶液，處理24h。用箭頭鑷子戳破卵膜，使卵黃和囊胚游離于0.9%NaCl溶液中，后轉入5ml離心管中，用習慣吹打均勻后500rpm離心5min，棄上清，再加入4ml0.9%NaCl溶液捶打均勻，離心，重復2次。離心后收集細胞，棄掉上清液，然后向每個離心管中加入0.4%NaCl溶液，用滴管輕輕吹打成細胞懸液，34℃下低滲2h，每隔15min吹打一次。低滲2h后，向離心管中緩緩加入1ml預冷固定液，固定30min，每隔10min吹打一次。1000rpm離心8min，棄上清。加入3ml預冷固定液，固定30min，每隔10min吹打一次。1000rpm離心8min，棄上清，重復兩次。再加入3ml固定液后置于-20℃冰箱過夜，離心管用橡膠塞蓋嚴。取出過夜的固定后的細胞懸液，離心后，加入適當?shù)墓潭ㄒ狠p輕吹打均勻。取預先冰凍的載玻片甩掉冰水后迅速地上2-3滴細胞懸液，用嘴輕輕吹散細胞，自然干燥。用磷酸緩沖液稀釋10倍配置的Giemsa染液扣染20min，蒸餾水沖洗干凈，自然干燥后鏡檢觀察染色體數(shù)，記錄并拍照。

核仁數(shù)目銀染法：取少量發(fā)眼卵浸泡在固定液中，處理4h。用箭頭鑷子取出少量胚胎，在載玻片上敲打均勻，自然晾干。將載玻片放在60℃加熱板上，按照硝酸銀與明膠2︰1的比例滴加在細胞附著區(qū)開始染色。待溶液變成褐色時，用溫水沖洗載玻片，自然干燥后鏡檢。觀察每個胚胎的核仁數(shù)目，記錄并拍照。

以上四種方法中，紅細胞體積法和流式細胞儀法因為需要尾靜脈采血，須將人工誘導的虹鱒魚苗飼養(yǎng)一個階段才能做倍性鑒定，操作簡單，成本較低，但周期較長。染色體計數(shù)法和核仁數(shù)目銀染法在發(fā)眼卵期間就可以鑒定倍性，但樣本被直接破壞，操作和設備要求高，成本高于前兩種方法。在研究和生產(chǎn)中，根據(jù)實際情況，選取相應的鑒定方法，通常采用紅細胞體積法和核仁數(shù)目銀染法相結合的鑒定方法保證結果的準確率。確定倍性后可以剪掉脂鰭作為標記，以方便飼養(yǎng)管理。

3 總結

我國三倍體虹鱒制種技術研究已成功多年，但該項技術尚不成熟，誘導率不夠穩(wěn)定，也未能達到較大規(guī)模。分析原因主要有以下幾點：一是親魚的質量不佳，導致受精卵質量不高；二是設備不夠完善，受精卵在水浴處理時，水溫不穩(wěn)或分布不均；三是環(huán)境不符合要求，處理過程中未嚴格控制避光條件，使受精卵受到了外界光刺激；四是操作技術不夠細致，震動過于激烈，導致死卵的產(chǎn)生。總之，只有處理好制種過程中各方面的細節(jié)問題，才能獲得高質量的三倍體虹鱒魚苗。

進一步優(yōu)化三倍體制種方法，獲得穩(wěn)定的制種技術，提高三倍體虹鱒制種成功率，降低成本，以滿足國內商業(yè)化生產(chǎn)的需要，將是我國冷水漁業(yè)近期急需解決的問題。