南宮自艷，李 靜，白向賓

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

昆蟲經(jīng)過約3 億8 千萬年的演化，已經(jīng)發(fā)展成地球上種類繁多、數(shù)量巨大、分布廣泛的動(dòng)物類群之一(王心麗，2001)。全世界約有昆蟲1000多萬種，目前已發(fā)現(xiàn)、定名的昆蟲約100 多萬種。面對(duì)如此種類繁多的昆蟲家族，如何鑒定、辨別及進(jìn)行明確的分類歸納顯得尤為重要，所以昆蟲分類學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。昆蟲分類學(xué)是研究昆蟲類別及其異同和歷史淵源關(guān)系，并據(jù)此建立分類系統(tǒng)，以總結(jié)昆蟲進(jìn)化歷史，反映昆蟲家族自然系譜的一門基礎(chǔ)學(xué)科。傳統(tǒng)的分類學(xué)主要從綜合形態(tài)特征、生物學(xué)性狀及地理學(xué)信息等多種角度入手加以區(qū)分。然而面對(duì)昆蟲家族豐富的物種多樣性，這些傳統(tǒng)的分類方法遇到了諸多挑戰(zhàn)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是20 世紀(jì)70年代以來，分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，極大地促進(jìn)了分子生物技術(shù)在昆蟲分類學(xué)上的應(yīng)用發(fā)展。本文將從傳統(tǒng)分類學(xué)方法和現(xiàn)代生物技術(shù)2個(gè)方面介紹我國昆蟲分類學(xué)的研究進(jìn)展。

1 傳統(tǒng)的分類學(xué)方法

20 世紀(jì)中葉以來，我國生物分類學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了一些新的理論學(xué)派。以陳世驤為代表的進(jìn)化分類學(xué)派主要開展了物種概念論、特征分析標(biāo)準(zhǔn)以及進(jìn)化論與分類學(xué)關(guān)系的研究(陳世驤，1987)。其物種隔離概念、生態(tài)特征、行為特征、分布特征、形態(tài)特征的分析與判別方法，目前仍然是國內(nèi)分類鑒別和區(qū)系研究的基本指導(dǎo)思想。

支序分類理論及方法誕生于20 世紀(jì)60年代，80年代初才在我國昆蟲分類研究中得到應(yīng)用。尹文英(1983)、朱弘復(fù)(1984)以及黃大衛(wèi)(1996)等關(guān)于支序分析方法及昆蟲的分支系統(tǒng)學(xué)研究都曾經(jīng)取得令人矚目的成就。董建臻等(1997)利用支序分類的原理和方法，系統(tǒng)研究了長蝽類Lygaeoid 亞科以上階元間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。江世宏等(2001)運(yùn)用支序分類的原理和方法，利用計(jì)算機(jī)支序分類軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出中國叩甲科Elateridae 昆蟲12 亞科的譜系圖。

數(shù)值分類學(xué)是借助數(shù)值根據(jù)其性狀狀態(tài)將分類單位歸類成類元，其核心就是將所有的分類性狀加以等權(quán)處理，再以性狀間的相似性來進(jìn)行歸類。目前，昆蟲分類系統(tǒng)主要采用的形態(tài)學(xué)依據(jù)有:昆蟲的顏色和斑紋;翅的有無、性質(zhì)以及翅脈脈相;口器的類型及其變化;觸角類型及節(jié)數(shù);身體附屬物類型及其大小;馬氏管的數(shù)目;生殖器官及其他結(jié)構(gòu)部位的形態(tài)特征(查玉平等，2005)。利用數(shù)量性狀變異在區(qū)分某些形態(tài)差別不顯著的昆蟲時(shí)是非常有效的手段，方法如系統(tǒng)聚類、動(dòng)態(tài)聚類、圖論法、主成分分析、因子分析、對(duì)應(yīng)分析和模糊聚類等(喻泓等，2004)。朱弘復(fù)等(1975)利用數(shù)值分類的方法進(jìn)行蚜蟲的系統(tǒng)發(fā)育分類，開創(chuàng)了數(shù)值分類應(yīng)用于我國昆蟲分類的先河。劉友樵等(1982)和陳斌(1989)也都應(yīng)用數(shù)值分類分別對(duì)草蛾屬Ethmiids 與星天牛屬Anoplophora 進(jìn)行分類研究。許升全等(1999)通過對(duì)蝗總科Acridoidea 昆蟲雌性下生殖板性狀的數(shù)值分類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，這是高級(jí)分類階元數(shù)值分類的一個(gè)示例。南宮自艷等(2013)的研究發(fā)現(xiàn)馬尾松毛蟲、落葉松毛蟲、云南松毛蟲、思茅松毛蟲4種松毛蟲的8個(gè)表型性狀(蛹重、蛹長、雌雄蟲體重、雌雄蟲翅展和雌雄蟲體長)在4種松毛蟲之間差異極顯著;主成分分析表明蛹長、雌蟲體重和雌蟲翅展3個(gè)主分量構(gòu)成的信息量基本能代表這8個(gè)性狀的變異;系統(tǒng)聚類的結(jié)果為馬尾松毛蟲與落葉松毛蟲聚為第一分支，思茅松毛蟲和云南松毛蟲聚為第二分支。

2 現(xiàn)代生物技術(shù)在昆蟲分類學(xué)中的應(yīng)用

昆蟲生存環(huán)境的改變引起新陳代謝和機(jī)能的改變，從而導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，僅從表型上不能解決諸如形態(tài)極其相似的近緣種分類問題，對(duì)物種的進(jìn)化關(guān)系也不能很好反映。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起及日臻成熟，各種分子標(biāo)記技術(shù)大量出現(xiàn)，不但能協(xié)助傳統(tǒng)分類學(xué)方法揭示相似姊妹種之間的差異，更有助于發(fā)現(xiàn)物種的起源和進(jìn)化規(guī)律以及田間昆蟲抗性種群的遺傳變異(Parker et al.，1998;龔鵬等，2001;Yuan et al.，2012)。

2.1 同工酶和等位酶電泳技術(shù)

同功酶(isozyme)是具有相同或相似的催化功能而分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶。自從Hunter 和Markert(1957)創(chuàng)立了同功酶酶譜(zymogram)技術(shù)以來，同功酶的研究得到了很大的發(fā)展。通過同功酶研究，可以由生化特征的差異來推測(cè)物種乃至屬、族、亞科等高級(jí)分類階元在蛋白水平上的異同，進(jìn)而可推測(cè)其親緣關(guān)系和進(jìn)化地位。韓雅莉等(1998，1999)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)斑翅蝗科Oedipodidae 和網(wǎng)翅蝗科Arcypteridae部分種類進(jìn)行酯酶同工酶研究，發(fā)現(xiàn)各自特有的酶帶在不同種類蝗蟲中差異顯著。鱗翅目害蟲多以幼蟲危害作物，但幼蟲形態(tài)分化不明顯，其近緣種、近似種更難區(qū)別，應(yīng)用同功酶測(cè)定技術(shù)則可以快速鑒定種類。例如閻一林等人(1987)的研究證實(shí)可以通過同功酶電泳分析快速區(qū)分棉鈴蟲 Helicoverpa armigera(Hübner)和 煙 青 蟲Helicoverpa assulta(Guenee)。羅梅浩等(1999)對(duì)云南、河南、北京地區(qū)來自不同體色、不同寄主的煙青蟲H.assulta(Guenee)種群進(jìn)行酯酶同功酶酶譜分析，表明河南種群與北京種群之間異較小，與云南種群之間差異較大。不僅如此，同功酶研究還為昆蟲種類更高階元的合理劃分提供科學(xué)依據(jù)，甚至對(duì)一些階元的能否成立提出肯定或否定的結(jié)論。聶傳朋等(2005)分析研究了葉甲亞科Chtysomelinae 5種昆蟲的酯酶同工酶的酶譜，表明該法所得到的分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致。李紹文等(1987)研究了膜翅目昆蟲7個(gè)總科、蜜蜂總科9個(gè)屬、蜜蜂屬6個(gè)種和西方蜜蜂4個(gè)種樣品的酯酶同工酶，發(fā)現(xiàn)總科間酶譜的差異大于總科內(nèi)各屬間的差異，屬內(nèi)各種間的酶帶差異不顯著，但每個(gè)種都有其特有的酶帶。

等位酶是由單個(gè)位點(diǎn)上等位基因編碼的同工酶，選取一批受單位點(diǎn)不同等位基因編碼的等位酶作為整個(gè)基因組的隨機(jī)樣本，可以比較客觀地度量生物遺傳變異的大小，并作為遺傳標(biāo)記研究其它相關(guān)問題(Gottlieb，1981;Soltis，1989;葛頌，1994)。由于等位酶譜帶同等位基因之間的明確關(guān)系，使其成為一種十分有效的遺傳標(biāo)記，是近年來檢測(cè)遺傳多樣性應(yīng)用最普遍的方法，在昆蟲系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究中應(yīng)用廣泛(王仲仁，1996)。徐廣等人(2000)利用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳檢測(cè)了棉鈴蟲H.armigera(Hübner)的13種等位酶，結(jié)果表明棉鈴蟲種群內(nèi)存在很高的遺傳多態(tài)性，種群間遺傳分化程度較小，種群間沒有基因交流的障礙，由此推測(cè)是遷飛阻礙了不同地理種群間的遺傳分化。南宮自艷等(2008)采用等位酶電泳技術(shù)研究了松毛蟲屬Dendrolimus 4種共9個(gè)地理種群的遺傳多樣性和遺傳分化，研究結(jié)果證實(shí)松毛蟲居群間存在較少的基因交流和較大的遺傳分化，并同時(shí)采用傳統(tǒng)的數(shù)值分類法對(duì)結(jié)果加以佐證(南宮自艷等，2013)。由此可見，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類及數(shù)值分類與分子生物學(xué)結(jié)合進(jìn)行昆蟲分類的研究，可以使各分類階元內(nèi)及不同階元間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及遺傳分化得到更精確的區(qū)分，并為糾正傳統(tǒng)分類中的偏差提供了一個(gè)有效的方法。

2.2 比較線粒體基因組學(xué)

線粒體是一種幾乎存在于所有真核生物的細(xì)胞器，與能量代謝、凋亡、衰老以及疾病相關(guān)，是氧化磷酸化的場(chǎng)所(魏書軍等，2011)。動(dòng)物線粒體基因組(mtDNA)具有基因組成穩(wěn)定、基因排列相對(duì)保守、普遍為母系遺傳、極少發(fā)生重組等許多共有特征(Wolstenholme，1992)，是目前研究種群遺傳變異分化、以及區(qū)別近緣種、種下分類單元鑒定中最常用的遺傳物質(zhì)之一(Wilson et al.，1985)。昆蟲作為地球上種類最為繁多、生物學(xué)習(xí)性最為復(fù)雜的生物，一直以來都是線粒體基因組研究的熱點(diǎn)類群(Boore，1999;Chen et al.，2011)。

常用的mtDNA 基因有細(xì)胞色素B(Cyt b)、細(xì)胞色素氧化酶I(COI)、細(xì)胞色素氧化酶II(COⅡ)、12SRNA、16SRNA、細(xì)胞核核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、NADH 脫氧酶亞基1(ND1)、NADH 脫氧酶亞基2(ND2)、NADH 脫氧酶亞基5(ND5)。相比其他基因片段來講，COI 相對(duì)保守并且容易被通用引物擴(kuò)增出來，同時(shí)也有足夠的變異將不同物種區(qū)分開(Wang et al.，2012);線粒體12S 和16S 基因也被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育分析中，但這類基因本身存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，使序列比對(duì)受限;COILND1 及ND5 均屬進(jìn)化比較快的基因，適用于區(qū)分親緣關(guān)系較密切的種類。而Cyt b 基因是mtDNA 蛋白質(zhì)編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能研究得最為清楚的基因之一，在昆蟲分類學(xué)及遺傳進(jìn)化研究中的應(yīng)用也更為廣泛(張學(xué)衛(wèi)，2010)。Huang 等人(2000)應(yīng)用Cyt b 基因和16S rRNA 基因序列的聯(lián)合數(shù)據(jù)對(duì)北美蟋蟀屬Gryllus 11種13個(gè)種群的系統(tǒng)演化關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)歐洲的Gryllus 屬與北美洲的Gryllus 屬間具有明顯的分枝，種間差異大于種內(nèi)差異。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用Cyt b 基因進(jìn)行的研究工作也日益增多。任竹梅等(2002，2003)對(duì)蝗總科8 科10種昆蟲的Cyt b 基因部分序列進(jìn)行測(cè)定分析，提出了8 科的親緣關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)不完全一致;同時(shí)對(duì)山稻蝗Oxya agavisa 及其相關(guān)物種Cyt b 基因序列進(jìn)行遺傳關(guān)系研究。李愛玲等(2004)分析了我國野桑蠶Bombyx mandarina 的Cyt b 序列并與日本野桑蠶進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示中國野桑蠶B.mandarina與家蠶B.mori 品種序列的遺傳分化時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于日本野桑蠶和家蠶品種相應(yīng)序列的分化時(shí)間，在分子水平上證實(shí)了家蠶起源于中國野桑蠶。王帥宇等(2005)發(fā)現(xiàn)Cyt b 基因可以作為露螽屬Phanerotera種間的分子遺傳標(biāo)記，研究結(jié)果表明鐮尾露螽Phanerotera falcate 與齒尾露螽Phanerotera myollecrca 是分化較晚的類群，其次是瘦露螽Phanerotera gracilis，黑角露螽 Phanerotera ngiroantennata 是分化較早的類群。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(RAPD)

RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD)原理是用長度為9-10 bp 的隨機(jī)核苷酸引物，對(duì)基因組的DNA 進(jìn)行非定點(diǎn)PCR 擴(kuò)增，不同物種的基因組中與引物相匹配的堿基序列的空間位置和數(shù)目都有可能不同，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和數(shù)量也有可能不同，這些差異可以通過凝膠電泳顯示出來，從而進(jìn)行遺傳多態(tài)性的分析(Williams，1990;Karama et al.，2008)。RAPD 具有技術(shù)簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、只需少量的DNA 樣品、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。Pradeep 等(2005)利用RAPD方法研究了家蠶B.mori 長幼蟲期群體和短幼蟲期群體4 代幼蟲之間基因多態(tài)性差異，在這兩個(gè)不同的群體中表現(xiàn)出豐富的基因差異。張愛兵等人(2004)利用RAPD-DNA 指紋譜方法對(duì)中國松毛蟲屬Dendrolimus 8個(gè)種和亞種的親緣關(guān)系進(jìn)行比較，結(jié)果表明馬尾松毛蟲Dendrolimus punetatus punetatus Walker 和德昌松毛蟲 D.punctatus tehchangensis Tsai et Liu 遺傳距離最近，與文山松毛蟲D.punctatus wenshanensis Tsai et Liu.、赤松毛蟲D.spectabilis Butler、落葉松毛蟲D.superans Butler、云南松毛蟲D.houi Lajonquiere 遺傳距離次之，與思茅松毛蟲D.kikuchii Matsumura 遺傳距離最遠(yuǎn)。楊效文等(1999)用RAPD 技術(shù)研究了我國煙草上煙蚜Myzusper sicae Sulzer 的種群分化，數(shù)據(jù)顯示煙蚜的不同地理種群和不同體色之間DNA 均呈現(xiàn)出多態(tài)性，證實(shí)我國煙草上煙蚜的分化僅在種群水平上，并未達(dá)到亞種水平。唐樺(2002)結(jié)合RAPD 分子標(biāo)記和同工酶電泳兩種方法證明光肩星天牛Anoplophora glabripennis 和黃斑星天牛Anoplophora nobilis 應(yīng)統(tǒng)屬一個(gè)種，而在光肩星天牛這一種下可分為三個(gè)型:白斑型、黃斑型、黃白雜合型。

2.4 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星DNA，也稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat，SSR)DNA，其核心結(jié)構(gòu)是由1-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列，微衛(wèi)星DNA 的兩側(cè)是相對(duì)保守和專一的單拷貝序列，利用側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物可以特異性擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，使微衛(wèi)星DNA 從基因組中被選擇性地?cái)U(kuò)增出來，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增帶進(jìn)行多態(tài)性分析(Zhang，2004)。SSR標(biāo)記在真核生物基因組中數(shù)量多且分布均勻，具有高度的多態(tài)性和保守性，遵循孟德爾式遺傳規(guī)律和共顯性遺傳模式，是一種非常高效、準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究技術(shù)(Huntley and Clark，2007;Behura et al.，2012)。張德興(2004)研究發(fā)現(xiàn)在鱗翅目粉蝶和蛾類昆蟲中基因組所存在的微衛(wèi)星序列具有近似或者完全相同的側(cè)翼序列，這一研究結(jié)論為鱗翅目昆蟲微衛(wèi)星豐富度較低提供了可能的解釋。吉亞杰等(2005)通過構(gòu)建基因組文庫的方法篩選了10個(gè)馬尾松毛蟲微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)，但這10個(gè)位點(diǎn)不能完全應(yīng)用于松毛蟲屬其他種松毛蟲，再次說明了微衛(wèi)星標(biāo)記保守性和專一性強(qiáng)這一特點(diǎn)。Koshio 等(2002)通過對(duì)鱗翅目舞毒蛾Lymantria dispar L.3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明微衛(wèi)星標(biāo)記可以應(yīng)用于該物種種群親緣關(guān)系鑒定。沈利(2004)篩選得到家蠶22 對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物，研究發(fā)現(xiàn)家蠶品種可分為歐、日、中三大類，證明家蠶微衛(wèi)星標(biāo)記具有品種特異性，可以用作家蠶指紋圖譜分析的工具。

2.5 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-strand conformational poly-morphism，SSCP)原理是變性后的單鏈DNA 在不含變性劑的中性聚丙烯酸凝膠電泳時(shí)，遷移率除與DNA 的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA 單鏈所形成的構(gòu)象。這種構(gòu)象由DNA 單鏈堿基順序決定，其穩(wěn)定性靠內(nèi)部局部順序的相互作用來維持，相同長度的單鏈因其順序不同，甚至單個(gè)堿基的不同，所形成的構(gòu)象不同，導(dǎo)致遷移率的變化而出現(xiàn)泳動(dòng)變位(劉美佳等，2011)。SSCP 方法靈敏性高，所以這一分析技術(shù)廣受關(guān)注(Malekmohammadia et al.，2012)。Hiss等(1994)應(yīng)用SSCP 分子標(biāo)記法對(duì)胡蜂Vespidae及其科內(nèi)的幾個(gè)近緣種昆蟲DNA 進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)近緣種間的差異表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的替代，這種差異可以作為區(qū)別近緣種的依據(jù)。Coustaut 等(1995)利用SSCP 技術(shù)成功地區(qū)分黑腹果蠅Drosophila melanogaster 和地中海果蠅D.simulans，而這兩個(gè)近似種以前只能依靠雄外生殖器來鑒別。Sedlimair 等(2000)應(yīng)用SSCP 技術(shù)研究了步甲亞屬Orinocarabus 的進(jìn)化關(guān)系。李石柱(2003)應(yīng)用SSCP 分析多斑按蚊復(fù)合組(Anopheles macu-lates complex)5個(gè)成員種的28S 編碼區(qū)第3 結(jié)構(gòu)域的單鏈構(gòu)象多態(tài)，結(jié)果表明該技術(shù)可以用于各蚊種的鑒別研究。

3 問題與展望

現(xiàn)在對(duì)于昆蟲的分類鑒定，形態(tài)學(xué)觀察仍是最主要的研究手段。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，新的研究技術(shù)對(duì)昆蟲形態(tài)學(xué)之外的其他特征進(jìn)行分析，使研究方式由表及里，由宏觀轉(zhuǎn)向微觀，是對(duì)傳統(tǒng)昆蟲分類方法的一個(gè)補(bǔ)充與完善。同工酶電泳技術(shù)、核酸序列分析、RAPD 技術(shù)、SSR 技術(shù)、SSCP 等分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲分類研究中的應(yīng)用和有益探索，其準(zhǔn)確、客觀、靈敏的優(yōu)點(diǎn)尤為突出，驗(yàn)證了以往的研究結(jié)論，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類方法的不足，解決了傳統(tǒng)分類中所存在的學(xué)術(shù)疑難問題。但目前我國現(xiàn)代生物技術(shù)在昆蟲分類方面的應(yīng)用還處于起步階段，由于應(yīng)用時(shí)間不長，無論是試驗(yàn)技術(shù)還是數(shù)據(jù)處理分析都還有待完善，適用范圍也有一定的限制?？傊?，昆蟲分類學(xué)是一門綜合性學(xué)科，在利用外部形態(tài)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，可以利用解剖學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合，各取所長，提高效率，昆蟲分類學(xué)研究技術(shù)將會(huì)有長足的進(jìn)步和發(fā)展。

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