胡煒彥， 于浩飛， 張榮平*

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床研究院，云南 昆明 650500)

神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是大腦衰老、疾病的病理學(xué)特征之一，因此保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抵抗氧化損傷有著重要的意義。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)記憶環(huán)節(jié)中起著十分重要的作用。在神經(jīng)退行性疾病患者中，腦組織萎縮和腦實(shí)質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少程度比正常老年人更為明顯，海馬也是最早受累的部位之一[1-2]。人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)，為五加科植物人參或三七中提取分離出的微量皂苷類成分，目前，大部分的研究集中在人參皂苷Rg3抗腫瘤方面的作用[3-6]，也有文獻(xiàn)報(bào)道人參皂苷Rg3對(duì)腦缺血大鼠腦線粒體損傷具有明顯的保護(hù)作用，該作用可能與清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗Ca2+有關(guān)[7]。有研究證實(shí)人參及人參或三七中提取分離出的皂苷類成分(如人參皂苷Rb1、Rg1等)具有保護(hù)神經(jīng)損傷的作用，能夠改善認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶功能[8-10]。但關(guān)于人參皂苷Rg3在神經(jīng)元保護(hù)方面報(bào)道較少，因此，本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，以H2O2制備氧化應(yīng)激損傷模型，研究人參皂苷Rg3預(yù)處理對(duì)H2O2所致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 孕18 d C57小鼠，購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滇)-2011004。

1.2 試劑與儀器 神經(jīng)元培養(yǎng)基(Neurobasal medium)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Typsine)、杜氏磷酸緩沖液(DPBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、聚乙二醇辛基苯基醚100(Triton-X 100)、Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、青霉素-鏈霉素(P/S)、胎牛血清(FBS)、B27、CCK-8試劑盒，L-多聚賴氨酸(PLL)等均購(gòu)自Invitrogen公司。人參皂苷Rg3(云南中醫(yī)學(xué)院周志宏教授提供)。H2O2(購(gòu)自Sigma公司)。

核糖核酸(RNA)提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司)。GAPDH及Caspase-3基因引物均由Invitrogen公司(上海)合成。GAPDH，上游引物F：TGACGTGCCGCCTGGAG AAA，下游引物R：AGTGTAGCCCAAGATGCC CTTCAG；Caspase-3，上游引物F：ACCGATGTCGAT GCAGCTAA，下游引物R：GGTGCGGTAGAGT AAGCATA。

2 方法

2.1 小鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng) 取孕齡為18 d的C57小鼠，脫臼處死后無菌操作取出胎鼠的海馬，剪碎，0.125% Typsine 37 ℃消化15 min，用含10% FBS 的DMEM終止消化后，75 μm篩網(wǎng)濾過，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清。再次加Neurobasal medium 混懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加Neurobasal medium 混懸，測(cè)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為5.2 × 105個(gè)/mL，接種于用PLL(0.01% solution) 包被過的96孔板和6孔板中。培養(yǎng)至72 h后加入終質(zhì)量濃度為2.5 mg/L阿糖胞苷純化神經(jīng)元。于第7天用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 神經(jīng)元總RNA 提取 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積二甲基亞砜(DMSO)作試劑空白對(duì)照組。6 h后，加入Trizol裂解液，按RNA 提取試劑盒說明書操作，提取總RNA。

2.3 RT-PCR反應(yīng) RT-PCR 操作按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下：逆轉(zhuǎn)錄體系包括標(biāo)本總RNA 500 ng，緩沖液 5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1.25 μL, 寡核苷酸1.25 μL, 6核苷酸的隨機(jī)引物5 μL，不含RNase 的水補(bǔ)齊至25 μL。37℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，cDNA置4 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液5 μL，上游引物0.20 μL，下游引物0.20 μL，cDNA產(chǎn)物1 μL加熒光定量PCR參比染料 0.20 μL，不含RNase 的水 2.8 μL至總體系為10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s， 95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。

2.4 神經(jīng)元形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，相同體積DMSO作試劑空白對(duì)照組。6 h后，置倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

2.5 神經(jīng)元細(xì)胞活力測(cè)定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照組，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元。6 h后，加入每孔加入20 μL CCK-8溶液，設(shè)定加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為試劑空白對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h。在450 nm測(cè)定吸光度。

各組細(xì)胞活力=(各組吸光度/溶劑空白對(duì)照組吸光度)×100%

2.6 培養(yǎng)液中LDH 測(cè)定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書測(cè)定培養(yǎng)液中LDH漏出量。

2.7 細(xì)胞內(nèi)SOD 活性和MDA 測(cè)定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，去除原培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/L的EDTA(pH 8.0)1 mL，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，將培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 min 使之溶解，加入25%的H3PO4100 μL，10 000×g于4 ℃離心1 h，取上清液，按說明書測(cè)定SOD 活性和MDA水平。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3對(duì)H2O2損傷神經(jīng)元caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，可顯著上調(diào)海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)；與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L )組，caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯下降，結(jié)果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉(zhuǎn)H2O2引起的海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)，見表1。

表1 人參皂苷Rg3對(duì)Caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響

3.2 人參皂苷Rg3對(duì)H2O2損傷神經(jīng)元形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，神經(jīng)元形態(tài)出現(xiàn)萎縮，軸突斷裂，細(xì)胞碎片較多。與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L)組，神經(jīng)元形態(tài)完好，軸突未見斷裂，細(xì)胞碎片較少，見圖1。

3.3 人參皂苷Rg3對(duì)H2O2損傷神經(jīng)元細(xì)胞活力及LDH漏出的影響 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果表明，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，可顯著降低小鼠海馬神經(jīng)元的活力，細(xì)胞膜通透性增大，培養(yǎng)液中LDH的水平顯著增加。與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L)組，小鼠海馬神經(jīng)元活力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 的漏出量明顯降低。結(jié)果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉(zhuǎn)H2O2引起的海馬神經(jīng)元活力下降，減少LDH的漏出。見表2。

圖1 人參皂苷Rg3對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的影響

表2 人參皂苷Rg3對(duì)H2O2 損傷海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

3.4 人參皂苷Rg3對(duì)MDA水平和SOD活性的影響 與試劑空白對(duì)照組相比，小鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)50.0 μmol/L的H2O2處理6 h后，培養(yǎng)液中MDA水平顯著增加，SOD活性顯著降低；預(yù)先給予人參皂苷Rg3(10，50 μmol/L) 預(yù)處理30 min，可明顯降低培養(yǎng)液中MDA水平，升高SOD活性，結(jié)果見表3。

表3 人參皂苷Rg3對(duì)H2O2損傷海馬神經(jīng)元MDA水平和SOD活性的影響

4 討論

近年來隨著我國(guó)人口的迅速老齡化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病日益增多，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。氧化應(yīng)激(oxidative stress)和凋亡在衰老中的作用越來越受到人們的重視，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞老化、死亡等氧化損傷，直接參與了多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程，氧化損傷早于病理特征性改變[11-12]。H2O2是一種較強(qiáng)的氧化劑，極易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，形成高活性的氧自由基或羥基自由基，造成細(xì)胞損傷[13]。存在于細(xì)胞漿和線粒體里的一種金屬蛋白酶使神經(jīng)元發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA、SOD，能夠清除代謝產(chǎn)生的超氧陰離子，是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。因此，測(cè)定MDA、SOD活性既可以反映細(xì)胞損傷程度又可以判斷細(xì)胞損傷原因[14-15]。

細(xì)胞活性的高低可以反映細(xì)胞的代謝與增殖。Cell Counting Kit-8簡(jiǎn)稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

研究結(jié)果顯示H2O2(50 μmol/L)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元6 h，神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮，軸突斷裂，細(xì)胞碎片較多，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞活力下降，與對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯升高而胞內(nèi)SOD活性顯著降低，提示H2O2(50 μmol/L)所致海馬神經(jīng)元損傷與脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，人參皂苷Rg3可提高神經(jīng)元內(nèi)SOD活性并顯著降低胞內(nèi)MDA的水平，提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性，表明人參皂苷Rg3可明顯地減弱H2O2所造成的海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)SOD活性，抑制LDH漏出，降低MAD、cospuse-3水平有關(guān)。

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