劉 洋， 張學(xué)蘭， 李慧芬， 隋曉輝， 占方玲

(山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟南 250355)

荷葉為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血的功效，荷葉炭收澀化瘀止血[1]?，F(xiàn)代研究表明，荷葉生物堿和黃酮類成分為其主要活性成分。荷葉總生物堿具有降血脂、減肥、抑菌等作用[2-4]。荷葉總黃酮具有降血脂和保護(hù)心肌缺血作用[2,5]。荷葉黃酮類化合物主要為金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、槲皮素等[6]，荷葉生物堿類成分主要有荷葉堿、原荷葉堿、蓮堿等[7]。前期研究表明，荷葉炭可明顯縮短正常大鼠血漿活化部分凝血活酶時間和凝血酶原時間，增加大鼠血漿纖維蛋白原水平，其止血作用明顯強于生荷葉[8]；荷葉制炭后，荷葉堿、總生物堿損失殆盡，金絲桃苷、異槲皮苷量顯著降低，而槲皮素量升高6倍多[9-10]。但荷葉飲片止血的物質(zhì)基礎(chǔ)及荷葉制炭止血的機理目前尚不清楚。本實驗研究荷葉生、炭飲片總黃酮、總生物堿及金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、荷葉堿對兔體外凝血功能的影響，旨在發(fā)現(xiàn)荷葉飲片止血的活性物質(zhì)，探討荷葉制炭止血的炮制機理，并為制定荷葉飲片的炮制工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 健康新西蘭大耳白兔，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(許可證號：scxk魯20080002)。

1.2 儀器 FA1604N型電子天平(精密度為十萬分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；PM PLUS型紅外測溫儀(美國Raytek公司)；多星電炒鍋(淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司)；AYW8000型半自動凝血分析儀(南京瑞麥科技開發(fā)有限公司)；LDZ4-0.8型離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

1.3 藥物 荷葉購自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周鳳琴教授鑒定為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥葉經(jīng)加工而成的絲狀片。荷葉炭：取凈荷葉絲30 g，置電炒鍋內(nèi)，270 ℃(鍋底溫度)炒制10 min，取出，放涼。成品形如荷葉，表面棕褐色或黑褐色，得率為73.8%。

荷葉堿對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號為111566-200402，純度大于98%)；槲皮素、金絲桃苷、異槲皮苷(本課題組自制，純度均大于98%)；枸櫞酸鈉(天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司，批號20110407)；凝血酶原時間測定試劑盒(PT，批號20110915)、活化部分凝血活酶時間測定試劑盒(APTT，批號20110915)、血漿纖維蛋白原測定試劑盒(FIB，批號20110915)，均購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 荷葉生、炭飲片總黃酮的制備 稱取荷葉炭粗粉135 g、生荷葉粗粉183 g(按得率計算，相當(dāng)于炒荷葉炭135 g)，分別用10、8倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇得浸膏。取浸膏加水超聲使其充分混懸，離心，取上清液通過D-101型大孔吸附樹脂，先用水洗至無色，再用50%乙醇洗至流出液無鹽酸鎂粉反應(yīng)，收集50%乙醇液，于水浴濃縮至干，取殘渣，減壓干燥，制備成荷葉生品、炭飲片總黃酮。

2.2 荷葉生、炭飲片總生物堿部位的制備 稱取荷葉炭粗粉135 g、荷葉片粗粉183 g(按得率計算，相當(dāng)于炒荷葉炭135 g)，分別用15倍量含0.1%HCl的70%醇浸泡提取3次，每次36 h。合并3次酸醇冷浸提取液，以40%NaOH溶液調(diào)pH 9～10。提取液50 ℃減壓回收乙醇，得浸膏；干浸膏加少量水溶解，用硅藻土拌樣，研細(xì)，室溫晾干。以10倍量乙酸乙酯索氏提取3 h，減壓回收乙酸乙酯；濃縮液用2倍體積的pH1的HCl溶液萃取2次；合并HCl溶液萃取液，以40%NaOH溶液調(diào)pH11；再以相同體積的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，減壓濃縮，加入40%NaOH溶液堿析，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，過濾，真空干燥，所得白色粉末即荷葉生、炭飲片總生物堿。

2.3 供試品溶液的制備 稱取荷葉生、炭飲片總黃酮、總生物堿適量，分別加適量80%乙醇超聲溶解，得相當(dāng)于生藥濃度0.2 g/mL的溶液，再分別配制成每1 mL相當(dāng)于0.2、0.02、0.002 g生藥的供試液。稱取金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、荷葉堿適量，分別加適量80%乙醇超聲溶解，分別配成濃度為3、30、300 μmoL/L的供試液。

2.5 結(jié)果

2.5.1 荷葉不同飲片總黃酮和總生物堿對兔體外凝血功能的影響 結(jié)果表明，生荷葉總黃酮組高、中劑量可明顯縮短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01)，低劑量對PT沒影響，可明顯縮短APTT(P<0.05)；荷葉炭總黃酮組各劑量均可縮短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且荷葉炭總黃酮高劑量組與高劑量生荷葉總黃酮組比較，PT、APTT也顯著縮短(P<0.05)，中劑量組對PT的影響也要高于同質(zhì)量濃度生荷葉總黃酮組(P<0.05)；生荷葉總生物堿組高、中劑量可明顯增長PT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對PT沒影響，高劑量可明顯增長APTT(P<0.01)，中、低劑量對APTT無影響；荷葉炭總生物堿各劑量組對PT、APTT均無明顯作用；荷葉生、炭飲片總黃酮和總生物堿各劑量組對FIB含量均無明顯影響。結(jié)果見表1。

表1 荷葉不同炮制品提取物及主要部位對PT、APTT、FIB的影響

2.5.2 荷葉4種化合物對兔體外凝血功能的影響 研究顯示，金絲桃苷組高、中劑量可明顯縮短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對PT、APTT無明顯影響；異槲皮苷組同上；荷葉堿組高、中劑量可明顯增長PT(P<0.01)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低劑量對PT、APTT無明顯影響；槲皮素組各劑量均可明顯縮短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且與同質(zhì)量濃度的金絲桃苷組與異槲皮苷組比較，PT、APTT也顯著縮短(P<0.01或P<0.05)；但各組對FIB水平均無明顯影響。結(jié)果見表2。

表2 荷葉4種化合物各單體對PT、APTT、FIB的影響

3 小結(jié)與討論

3.1 體外凝血實驗表明，荷葉生、炭飲片總黃酮及金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素均可顯著縮短兔血漿PT和APTT，具有較好的凝血活性；荷葉炭總黃酮的凝血作用強于生荷葉總黃酮，槲皮素的凝血作用強于金絲桃苷和異槲皮苷；荷葉堿、生荷葉總生物堿均可明顯延長兔血漿APTT和PT，具有抗凝血作用。上述研究說明，黃酮類成分為荷葉生、炭飲片止血活性物質(zhì)，荷葉堿、生荷葉總生物堿為荷葉抗凝血成分。

3.2 金絲桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)和異槲皮苷(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)的苷元均為槲皮素。為了探討荷葉金絲桃苷和異槲皮苷在炒炭過程中的轉(zhuǎn)化機制，取金絲桃苷、異槲皮苷對照品，分別置坩堝中，于烘箱中 270 ℃烘制3 min，制備各單體成分模擬炮制品。以槲皮素對照品為對照，采用HPLC對各單體成分模擬炮制品進(jìn)行分析，結(jié)果在金絲桃苷、異槲皮苷的模擬炮制品中均檢出槲皮素。說明在荷葉制炭過程中，金絲桃苷、異槲皮苷受熱分解生成其苷元槲皮素。

3.3 甲基蓮心堿可阻滯鈣離子通道、抗血小板聚集和抗血栓形成[11]，蓮心堿具有抗血小板聚集和抗凝血作用[12]。荷葉生、炭飲片總生物堿的高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜分析表明， 荷葉炭品中蓮心堿、N-甲基異衡州烏藥堿、杏黃罌粟堿、 衡州烏藥堿及2-羥基-1-甲氧基阿樸啡的含量顯著低于生荷葉, 而荷葉中荷葉堿、N-降荷葉堿、番荔枝堿、甲基蓮心堿制炭后消失[13]。綜合本實驗結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)分析認(rèn)為，荷葉制炭后止血作用增強的主要原因是：(1)抗凝血成分荷葉堿、甲基蓮心堿、蓮心堿等生物堿量顯著降低；(2)具有止血作用的金絲桃苷、異槲皮苷轉(zhuǎn)化為止血作用更強的槲皮素。本研究為制定荷葉飲片的炮制工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亦提供了專屬性科學(xué)依據(jù)。

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