廖冬燕, 肖穎梅, 屈澤強, 夏 星*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)為伴隨著機體老齡化而出現(xiàn)的神經(jīng)退行性病變，其發(fā)病率隨年齡增長呈顯著增加，Aβ蛋白(amyloid β peptide，Aβ)的大量積累導(dǎo)致大腦老年斑的形成及大量的神經(jīng)元損失是阿爾茨海默氏病的關(guān)鍵病理特征[1]。氧化應(yīng)激常在生命活動的能量代謝過程中出現(xiàn)，當(dāng)機體的抗氧化系統(tǒng)不能及時清除能量代謝所產(chǎn)生的大量氧自由基和活性氧，就會造成質(zhì)膜細胞器及細胞中的各種蛋白質(zhì)和核酸受到氧化損傷，引發(fā)氧化應(yīng)激，此外各種環(huán)境污染物、紫外線照射等也導(dǎo)致氧自由基大量增加而引發(fā)氧化應(yīng)激[2]。老齡機體內(nèi)氧化應(yīng)激造成的損傷也隨年齡呈進行性增強，這也是引發(fā)阿爾茨海默氏病患者神經(jīng)退行性病變的重要原因。三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen為我國常用中藥，有散瘀止血，消腫定痛的功效，中醫(yī)常于止血、補血及治療各種血瘀證。三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins, PNS)為三七中主要的活性成分，當(dāng)前臨床上常用于腦血管疾病后遺癥及各種血栓性疾病的治療。經(jīng)多方研究發(fā)現(xiàn)，PNS對癡呆癥有明顯的治療作用[3-4]。本課題組前期研究也已證實，PNS能顯著緩解體外培養(yǎng)的PC12細胞的氧化應(yīng)激程度，增強細胞的抗氧化能力[5]。本研究進一步關(guān)注于PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中Aβ生成的影響，為闡明其治療阿爾茨海默氏病的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12細胞購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 實驗試劑 三七總皂苷由云南玉溪維和制藥廠生產(chǎn)(批號 20100701)。DMEM/high glucose購買于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司(批號NXBO566)；無支原體胎牛血清購買于杭州四季清生物工程材料有限公司(批號090603)； 淀粉樣前體蛋白(APP，批號 201205)，α-分泌酶(批號 201205)，β-分泌酶(批號 201205)及γ-分泌酶(批號 201205)的ELISA檢測試劑盒均為Raybio 公司產(chǎn)品(進口分裝)；Western blot用一抗APP(批號 297543)，早老素-1(PS-1，批號 Y-AB3-07E02A)均購買武漢博士德生物工程有限公司。Western blot所用其它試劑(批號 20120228)均購于碧云天生物技術(shù)研究所。Taq酶(批號 20111201)為BioFlux公司產(chǎn)品；DNA ladder(批號25911J)為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒(批號 K0208)，dNTP(批號K0103)為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖(批號 111860)為西班牙BIOWEST產(chǎn)品；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器 DLE560超凈工作臺(荷蘭clearAir公司)；311型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma)；Sorvall ST16R超低溫離心機(Thermo Fisher)；DML 3000B倒置熒光顯微鏡(萊卡儀器有限公司)；EPOCH 酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)，JY92超聲波粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Criterion蛋白印跡系統(tǒng)及Universal通用型電源，均為美國Bio-rad產(chǎn)品；Gel Logic 212 PRO凝膠成像系統(tǒng)及 Image station system 4000MM分子影像系統(tǒng)，均為美國Carestream產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 PC12細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液， 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，每2天傳代1次。待細胞增長至80%融合時，用0.25%胰酶消化細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1×105個/mL后傳代或接種于細胞培養(yǎng)板。前期實驗已經(jīng)確定PNS增強細胞抗氧化能力的最佳濃度，本研究即在該濃度下考察PNS對細胞Aβ生成的影響，故實驗分別設(shè)正常組(不加藥物正常培養(yǎng)的細胞)，模型組(不經(jīng)藥物處理，用H2O2400 μmol/L處理)，維生素E組(Vit-E，1 μg/mL)，PNS 1、0.1 mg/mL組(同模型組，并分別用PNS 1、0.1 mg/mL處理)，同時設(shè)無細胞的空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞于接種18 h后，向培養(yǎng)液中加入相應(yīng)藥物處理24 h。之后按照文獻方法誘導(dǎo)細胞的氧化應(yīng)激[6]，除正常組外，均給予終濃度為400 μmol/mL的H2O2損傷1 h造成氧化應(yīng)激模型，收集細胞供各項指標(biāo)的檢測。

2.2 ELISA檢測APP，α-分泌酶、β-分泌酶及γ-分泌酶水平 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1×105個/mL接種于6孔板。分組及藥物處理同“2.2”項。完成給藥及H2O2處理后，采用細胞刮徹底收集細胞，超聲破碎細胞，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清液按照試劑盒方法測定細胞勻漿中APP，α-分泌酶、β-分泌酶及γ-分泌酶水平。

2.3 RT-PCR檢測Aβ生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1×105個/mL接種于培養(yǎng)瓶。分組及藥物處理同“2.2”項。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，以TRIzol裂解細胞，提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠中，于150 V電泳30 min，同時將RNA適度稀釋后測定OD260及OD280。觀察18 s和25 s條帶清晰，亮度比約為1∶2，無明顯降解，且OD260/OD280在1.8～2.0，即認(rèn)為提取的RNA 質(zhì)量合格。根據(jù)測定的OD260將RNA稀釋至0.2 μg/μL，按照TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒方法將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。取6 μL稀釋后的cDNA，加入Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP 4 μL, 上、下游引物各0.8 μL，Taq酶0.3 μL，加ddH2O補充體積至25 μL，PCR引物分別為：GAPDH上游引物F：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，下游引物R：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA；PS-1 F：ACAGAGACTTGACAACCCTG，下游引物R：AGGCATGGATGACCTTGTAG；β-分泌酶(BACE)上游引物F：TGCCATCACTGAATCGGACAA，下游引物R：AAGATGTTCGGAATGTGGGTCTG；金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)蛋白-10(ADAM10)上游引物F：ACTACTGCTTGGCCTATGTC，下游引物R：GTAGCCACAGTCACACTCTT。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。PCR儀擴增程序為：95 ℃，2 min預(yù)變性，94 ℃，35 s變性，56 ℃左右，40 s退火，72 ℃，45 s延伸，擴增25～40個循環(huán)后72 ℃充分延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠上樣，80 V下，電泳30 min，Gel Logic 212 PRO凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 4.40軟件對結(jié)果圖片進行灰度分析，以各目的基因與內(nèi)參基因(Gapdh)的灰度值之比作為目的基因的相對表達量。

2.4 Western Blotting檢測Aβ生成相關(guān)蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至1×105個/mL接種于培養(yǎng)瓶。分組及藥物處理同“2.2”項。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃裂解細胞30 min，收集裂解物細胞4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，稀釋蛋白質(zhì)量濃度至3 mg/mL，PCR儀100 ℃變性6 min。15%和8% SDS-PAGE 110 V分離樣品。于低溫100 V 1 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h。分別以適量稀釋的APP(1∶100)、PS-1(1∶100)、ADAM10(1∶100)、Gapdh(1∶200)一抗，封閉過夜。TBST 充分洗滌后，將膜與溶于封閉液中的二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶3 000)室溫孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，以Image station system 4000MM對經(jīng)化學(xué)發(fā)光處理的PVDF膜進行實時數(shù)碼曝光，保存數(shù)碼曝光結(jié)果。采用Quantity One 4.40軟件對結(jié)果圖片進行定量分析，以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白(Gapdh)定量灰度值之比作為目的蛋白的表達量。

3 結(jié)果

3.1 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中APP蛋白，α-分泌酶、β-分泌酶及γ-分泌酶水平的影響 實驗結(jié)果見表1。模型組 PC12 細胞的APP蛋白水平有增加的趨勢，但與正常組沒有顯著差異(P>0.05)，1 μg/mL的PNS能顯著降低APP蛋白水平。模型組細胞α-分泌酶水平較正常組顯著降低(P<0.05)，而使用0.1 μg/mL PNS顯著提高α-分泌酶水平，1 μg/mL PNS僅有提高α-分泌酶水平的趨勢。PC12細胞經(jīng)H2O2刺激后，其β-分泌酶水平?jīng)]有顯著變化，PNS對β-分泌酶水平也沒有顯著影響。PC12細胞中γ-分泌酶水平在H2O2刺激后顯著升高(P<0.001)，0.1、1 μg/mL PNS均能顯著降低γ-分泌酶水平(P<0.01)。

表1 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中APP、α-分泌酶、β-分泌酶及γ-分泌酶水平的影響

3.2 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中ADAM10、BACE及PS-1基因轉(zhuǎn)錄的影響 實驗結(jié)果見表2及圖1。經(jīng)H2O2處理后，模型組細胞ADAM10 mRNA表達顯著降低(P<0.01)，PNS 1、0.1μg/mL均能顯著增加ADAM10 mRNA的表達(P<0.01，P<0.001)。模型組BACE mRNA表達量顯著高于正常組(P<0.05)，PNS只有較弱的減少BACE mRNA表達的趨勢。模型組PS-1 mRNA表達量顯著高于正常組(P<0.05)，PNS 1、0.1 μg/mL均能顯著減少PS-1 mRNA的表達(P<0.05，P<0.01)。

表2 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中ADAM10、BACE及PS-1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

3.3 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中APP，ADAM10及PS-1蛋白表達的影響 實驗結(jié)果見表3及圖2。經(jīng)H2O2處理的PC12細胞中，APP蛋白表達顯著高于正常組(P<0.05)，0.1 μg/mL的PNS能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中APP蛋白的生成(P<0.05)。模型組PC12細胞接受H2O2處理后，ADAM10蛋白表達顯著減少(P<0.05)，1、0.1 μg/mL的PNS均能顯著增加ADAM10蛋白表達(P<0.05)。模型組細胞接受PS-1蛋白表達顯著增加(P<0.05)，1、0.1 μg/mL的PNS均能顯著減少PS-1蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。

圖1 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中Gapdh，ADAM10，BACE及PS-1 mRNA表達的影響

表3 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中APP，ADAM10及PS-1 蛋白表達的影響

圖2 PNS對氧化應(yīng)激的PC12細胞中GAPDH，APP，ADAM10及PS-1蛋白表達的影響

4 討論

氧化應(yīng)激能通過激活細胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，催化環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的活化，從而促進APP蛋白的大量生成[7]，APP經(jīng)β-分泌酶及γ-分泌酶的加工后形成的Aβ蛋白，具有很強的寡聚特性。氧化應(yīng)激還可以通過炎癥細胞因子途徑，增加Aβ蛋白的生成。如Gu等[8]在過氧化氫刺激的SH-SY5Y細胞中發(fā)現(xiàn)，過氧化氫的刺激能使APP及BACE上游啟動子去甲基化，促進使DNA與NFr-κB的結(jié)合，此外還通過影響組蛋白去乙?；?，進一步在基因表達的調(diào)控水平增加了Aβ蛋白的生成。此外，氧化應(yīng)激還可通過激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，促進真核生物翻譯起始因子磷酸化，從而增加BACE1基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯水平，促進Aβ蛋白的積累[9]。而過度積累的Aβ蛋白反過來又進一步引發(fā)了新的氧化損傷[10]，如APP/PS-1轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠模型中就發(fā)現(xiàn)了非常顯著的免疫系統(tǒng)氧化應(yīng)激現(xiàn)象[11]。抑制Aβ蛋白加工成熟的治療手段可以減輕Aβ帶來的氧化損傷，如PS-1基因為γ-分泌酶復(fù)合物組分之一，F(xiàn)iorini等的研究發(fā)現(xiàn)，快速老化癡呆模型小鼠大腦經(jīng)PS-1反義沉默處理后，其學(xué)習(xí)記憶能力有所提高，大腦氧化應(yīng)激程度顯著減輕[12]。Webster等發(fā)現(xiàn)[13]， PC12細胞在經(jīng)慢性缺氧誘發(fā)的氧化應(yīng)激條件下，ADAM10表達量顯著減少，并且Aβ蛋白生成增加?？梢?，氧化應(yīng)激是引起細胞內(nèi)Aβ蛋白代謝異常的主要因素之一。目前已發(fā)現(xiàn)很多中藥來源的有效成分，可能通過緩解機體的氧化應(yīng)激，發(fā)揮對癡呆的治療作用[14]。

在本課題組前期研究中運用外源性的H2O2刺激PC12細胞，導(dǎo)致細胞進入氧化應(yīng)激狀態(tài)，PNS處理能減少細胞內(nèi)ROS水平，增強細胞內(nèi)的主要抗氧化酶，如SOD、GSH-Px的活力，緩解細胞的氧化應(yīng)激[5]。本研究在氧化應(yīng)激的PC12細胞中，觀察到了APP蛋白表達的增加，α-分泌酶表達減少以及γ-分泌酶的表達增加，可見，H2O2的刺激改變了細胞中APP蛋白的代謝水平，引發(fā)Aβ蛋白的積累從而導(dǎo)致Aβ蛋白介導(dǎo)的細胞退行性病變。更有意思的是，PNS的處理減少了氧化應(yīng)激引起的PC12細胞中APP蛋白積累，增加了α-分泌酶表達，并減少γ-分泌酶的表達?？梢姡徑庋趸瘧?yīng)激造成的Aβ蛋白代謝異常也是PNS治療阿爾茨海默氏病的可能途徑之一。

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