王 嬋，王新敏，季 榕，張宇晴，王飛雨，吳江東，吳 芳，張萬江，章 樂

結(jié)核仍是目前人類健康的一個(gè)巨大威脅, 據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),2010年全球有145萬人死于結(jié)核桿菌的感染[1]。結(jié)核桿菌卡介苗(BCG)是目前唯一可獲得的預(yù)防結(jié)核病疫苗,但隨著耐多藥結(jié)核桿菌菌株的出現(xiàn)以及人類免疫缺陷病毒(HIV)合并結(jié)核桿菌交叉感染病例的增多,加快發(fā)展新型的疫苗是緩解這一全球性公共衛(wèi)生問題的有效措施[2]。但大多數(shù)研究數(shù)據(jù)顯示，新型DNA疫苗的效用與BCG相比，優(yōu)勢(shì)并不是特別明顯，完全替代的可能性不大。因此，新免疫策略的研制對(duì)防治結(jié)核桿菌感染及結(jié)核病的發(fā)生其作用非凡。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過大量的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究,針對(duì)BCG免疫保護(hù)的缺陷和新型疫苗研制的困鏡,BCG的序貫免疫策略(sequential immunization strategy)又稱初免-加強(qiáng)免疫策略(prime-boost regimen)[3]被提出用于TB的預(yù)防。即當(dāng)單用一種疫苗產(chǎn)生的免疫效力不足時(shí)，使用相同或不同的疫苗來重復(fù)免疫接種可增強(qiáng)免疫效果。因而有研究者以表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒與表達(dá)病原體保護(hù)性抗原的質(zhì)粒共同免疫, 希望通過細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用及佐劑作用增強(qiáng)宿主的特異性免疫應(yīng)答, 從而產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用[4]。

研究顯示, IL-12 在體內(nèi)外均能高效刺激并維持早期 Thl 型細(xì)胞應(yīng)答, 可作為結(jié)核病疫苗的佐劑,其免疫調(diào)節(jié)作用和佐劑作用能增強(qiáng)宿主的特異性免疫應(yīng)答,從而產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用[5-6]。而結(jié)核分枝桿菌Ag85A是結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)液分泌蛋白中具有較強(qiáng)免疫保護(hù)作用的抗原成分，分別含有多個(gè)不同的T、B細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞和體液免疫，是研究最多的TB候選DNA疫苗[7]。因此本研究利用BCG初免，加上已經(jīng)構(gòu)建好的表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒(IL-12)聯(lián)合結(jié)核分枝桿菌Ag85A DNA疫苗加強(qiáng)免疫的序貫免疫策略對(duì)小鼠的免疫效果進(jìn)行觀察。

1 材料和方法

1.1材料6～8周齡BALB/c雌性小鼠42只，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。pcAg 85A是以pcDNA3.1真核質(zhì)粒為載體構(gòu)建的表達(dá)型重組質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。IL-12是以pcDNA3.1真核質(zhì)粒為載體構(gòu)建的表達(dá)型重組質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。BCG由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存培養(yǎng)。Endo-free Plasmid Mini KitⅡ質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；TB-PPD購(gòu)自北京祥瑞生物制品公司；小鼠干擾素γ(IFN-γ)、IL-4、IL-2細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bio-source；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京博瑞克公司；XTT購(gòu)自BBI公司。

1.2方法

1.2.1DNA疫苗的制備 按照Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ質(zhì)粒小量抽提試劑盒說明書大量抽提質(zhì)粒IL-12、pcDNA3.1及pcAg 85A，以紫外分光光度計(jì)定量后，用PBS調(diào)整濃度為1.25 g/L備用。

1.2.2動(dòng)物免疫 將42 只小鼠隨機(jī)分為7組，A組：PBS對(duì)照組，B組：BCG組，C組：pcAg85A 組，D組:BCG/ pcAg85A組，E組：BCG/ pcAg85A +IL-12 組，F(xiàn)組：BCG/IL-12組，G組: BCG/pcDNA3.1組，每組6只小鼠。

A組小鼠在1周、3周、5周均注射PBS作為陰性對(duì)照；B組1周注射BCG，3、5周注射PBS；C組分別在1、3、5周以質(zhì)粒pcAg 85A免疫小鼠；D組小鼠在1周注射BCG，3、5周注射質(zhì)粒pcAg 85A加強(qiáng);E組1周注射BCG，3、5周注射質(zhì)粒pcAg 85A和質(zhì)粒IL-12加強(qiáng)；F組小鼠在1周注射BCG，3、5周注射質(zhì)粒IL-12加強(qiáng)；G組小鼠在1周注射BCG，3、5周注射質(zhì)粒pcDNA3.1加強(qiáng)作為對(duì)照。BCG菌懸液0.2 mL(106cfu/ mL) 于皮下注射，IL-12、pcDNA3.1、pcAg 85A以7.5 g/L布比卡因遞送，于脛前肌多部位注射，共50 μL，每只共計(jì)100 μg質(zhì)粒。

1.2.3特異性抗體IgG的檢測(cè)(ELISA法) 分別于小鼠加強(qiáng)免疫后4周，6周，8周摘除眼球取血，分離血清后-20 ℃凍存?zhèn)溆?。以TB-PPD標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/L)100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜，加5 g/L脫脂奶粉封閉2 h，再次洗板后，依次加入倍比稀釋的待測(cè)血清，洗板后加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG， OPD顯色后于波長(zhǎng)450 nm測(cè)定吸光度(A490)值。以PBS組小鼠血清作為陰性對(duì)照，A490值>0.05，A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組≥2.0時(shí)，判為陽性。將抗體滴度定義為：實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組A490比值≥ 2.0時(shí)為最大的血清稀釋倍數(shù)。

1.2.4特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(XTT法) 分別于加強(qiáng)免疫后4周，6周，8周，每組分別取2只小鼠，無菌條件下分離小鼠脾臟。每組小鼠脾細(xì)胞混合后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/L，100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。同時(shí)設(shè)對(duì)照孔和調(diào)零孔，實(shí)驗(yàn)組每孔加入PPD(1 μg/mL)進(jìn)行刺激，于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入XTT(5 g/L)4 μL以及VK32 μL(終濃度0.1 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定A450nm吸光值，結(jié)果用刺激指數(shù)(stimulation index, SI)表示。SI=A實(shí)驗(yàn)值/A對(duì)照組。

1.2.5細(xì)胞因子的誘生和測(cè)定 同樣制備的脾細(xì)胞調(diào)整密度為2×106/L，100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每組小鼠脾細(xì)胞做6個(gè)復(fù)孔，每孔加入TB-PPD標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/L)100 μL進(jìn)行刺激。于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清。IFN-γ和IL-4檢測(cè)采用Bio-Source ELISA試劑盒，按說明書操作，檢測(cè)樣品中IFN-γ和IL-4、IL-2含量。

2 結(jié) 果

2.1各組血清特異性抗體IgG的比較 用ELISA法對(duì)各組小鼠血清中抗TB-PPD抗體水平進(jìn)行了測(cè)定。免疫后4周，8周，BCG組， Ag85A , BCG/ Ag85A , BCG/ Ag85A+IL-12 , BCG/ IL-12組BCG/ pcDNA3.1在3個(gè)時(shí)間段的IgG與同時(shí)間段PBS組比較均有顯著性差異(P<0.05)。其中， BCG/ Ag85A+IL-12組IgG高于其它各組(P<0.05)(圖1)。

2.2特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 加強(qiáng)免疫后4周，6周，8周的小鼠脾細(xì)胞在體外經(jīng)PPD刺激后，BCG組，Ag85A ,BCG/ Ag85A , BCG/ Ag85A+IL-12 , BCG/ IL-12組BCG/ pcDNA3.1在3個(gè)時(shí)間段的增殖活性與同時(shí)間段PBS組比較均有顯著性差異(P<0.05)。其中,BCG/ Ag85A+IL-12組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖顯著高于其它各組(P<0.05)(圖2)。與加強(qiáng)免疫后4周相比，加強(qiáng)免疫后6周，8周 BCG/ Ag85A,BCG/ Ag85A+IL-12,BCG/ IL-12組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均呈上升趨勢(shì)，并且在加強(qiáng)免疫后8周達(dá)到較高水平。

圖1特異性抗體IgG的檢測(cè)

Fig.1Analysisofantibodyresponsesagainsttuberculin-purifiedproteinderivative(TB-PPD)

A: PBS group; B: BCG group; C: pcAg 85A group; D: BCG/pcAg 85A group; E: BCG/ pcAg85A +IL-12 group;F: BCG/IL-12 group;

G: BCG/pcDNA3.1group.

*P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-1.

圖2特異性脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

Fig.2Lymphoproliferativeresponsetothesetypesofvaccines.

A: PBS group; B: BCG group; C: pcAg 85A group; D: BCG/pcAg 85A group; E: BCG/ pcAg85A +IL-12 group; F: BCG/IL-12 group;

G: BCG/pcDNA3.1 group.

*P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.3IFN-γ表達(dá)水平 加強(qiáng)免疫后IFN-γ水平BCG/ Ag85A+IL-12組在3個(gè)時(shí)間段均高于其它各組(P<0.05)。從免疫6周開始，BCG/ Ag85A和 BCG/ IL-12組得IFN-γ水平高于PBS組，BCG組，Ag85A組(P<0.05)。BCG/ IL-12組顯著高于BCG/ Ag85A，但免疫8周后，BCG/ IL-12組和BCG/ Ag85A 組無顯著性差異(表1)。

表1IFN-γ變化水平

GroupIFN-γ (pg/mL)4-week6-week8-weekPBS62.2±10.2659.2±7.9861.6±7.99 BCG88.4±9.45?99.6±11.28?115.6±14.59? Ag85A101.6±18.47?110.2±17.74?135.6±18.69? BCG/ Ag85A118±14.4ab?#128±14.58?#△170±22.93?#△ BCG/ Ag85A+IL12128.2±20.4?△190.2±16.51?#△244.2±39.14?#△BCG/ IL12106.4±24.14?146.4±14.12?#165.6±27.39?# BCG/ pcDNA3.185.8±9.33?99±10.63?104.2±23.96?

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.4IL-2表達(dá)水平 加強(qiáng)免疫后IL-2水平BCG/ Ag85A+IL-12組在3個(gè)時(shí)間段均高于其它各組(P<0.05)。從免疫6周開始，BCG/ Ag85A和 BCG/ IL-12組得IL-2水平高于BCG組，Ag85A組(P<0.05)。免疫8周時(shí)，BCG/ IL-12組分泌的IL-2高于BCG/ Ag85A 組，有顯著性差異(表2)。

表2IL-2變化水平

GroupIL-24-week6-week8-weekPBS29.8±2.7725.8±4.7627.6±3.13BCG108.2±17.54159.4±21.69223±13.11acdeAg85A111±16.85160.1±21.06186.4±11.52BCG/ Ag85A123±10.07224.2±18.99?277.6±16.09?△BCG/ Ag85A+IL-12146.2±17.29?#△271.6±16.36?#△419.3±28.12?#△BCG/ IL-12123.6±19.63227.4±23.46?312.4±33.02?#BCG/ pcDNA3.1107.2±14.02152.6±21.38219.4±18.15

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group, #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group;

△P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.5IL-4表達(dá)水平 加強(qiáng)免疫后IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12組在3個(gè)時(shí)間段均高于其它各組(P<0.05)。從免疫2周開始，BCG/Ag85A組得IL-4水平高于BCG組，Ag85A組(P<0.05)。并且其IL-4明顯高于BCG/IL-12組(表3)。

3 討 論

表3IL-4變化水平

Tab.3ChangesofIL-4levelinculturemediumtothesetypesofvaccines(X±S,pg/mL,n=5)

GroupIL-44-week6-week8-weekPBS23±5.719.6±2.4114.2±2.59BCG41±6.6357.6±7.8971±2.55Ag85A32.6±4.7243.4±5.3253.2±6.22BCG/ Ag85A59.2±5.07?△62±4.36△82.8±8.26?△BCG/ Ag85A+IL-1268.6±6.62?#△96.6±5.5?#△117.4±10.71?#△BCG/ IL-1247.2±5.45#51.4±7.23#63.8±8.79#BCG/ pcDNA3.137.4±3.2154.2±7.0566.2±6.98

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

作為細(xì)胞介導(dǎo)免疫中具有重要作用的細(xì)胞因子—IL-12具有促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)成熟、誘導(dǎo)早期輔助性T母細(xì)胞(Thnaive)分化為Th1細(xì)胞、刺激T細(xì)胞和激活自然殺傷細(xì)胞(NK)使其分泌IFN-γ,并增強(qiáng)它們的裂解活性等作用。它能促進(jìn)T輔助細(xì)胞的極化過程向著Th1的方向進(jìn)行,在抗結(jié)核分枝桿菌感染中具有重要作用。同時(shí)IL-12對(duì)維持一定數(shù)量的Th1記憶細(xì)胞也是必需的[10]。研究發(fā)現(xiàn)將IL-12作為基因佐劑與分枝桿菌保護(hù)性抗原的真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更加有效的免疫保護(hù)作用[11]。

本研究結(jié)果表明,誘發(fā)TB-PPD特異性IgG抗體反應(yīng),BCG/Ag85A+IL-12免疫組小鼠血清特異性抗體增加最明顯，表明采用BCG初免，Ag85A+IL-12聯(lián)合免疫的序貫免疫策略后，能提高特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。而BCG/Ag85A+IL-12免疫4周后IgG水平開始升高，且6周或8周后小鼠血清中抗PPD IgG水平仍顯著高于其他各免疫組(P<0.05)(圖1)，進(jìn)一步表明實(shí)驗(yàn)組BCG/Ag85A+IL-12產(chǎn)生的抗體較持久，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增高。淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化是觀察細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一，結(jié)果顯示，在BCG初次免疫的基礎(chǔ)上，各免疫組抗原特異性脾淋巴細(xì)胞均有增殖。與加強(qiáng)免疫后4周相比，雖然加強(qiáng)免疫后6周，8周BCG/Ag85A，BCG/IL-12組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均呈上升趨勢(shì)，并且在加強(qiáng)免疫后8周達(dá)到較高水平。但BCG/Ag85A+IL-12免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖在各個(gè)時(shí)間段都顯著高于其它各組(P<0.05)(圖2)。這些結(jié)果表明，BCG初次免疫后，再用pcAg85A和IL-12聯(lián)合加強(qiáng)免疫，小鼠脾淋巴細(xì)胞發(fā)生了顯著的增殖轉(zhuǎn)化，其結(jié)果優(yōu)于其他的免疫方式。

進(jìn)一步研究顯示，采用BCG/Ag85A+IL-12聯(lián)合加強(qiáng)免疫小鼠后,可誘導(dǎo)較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖,產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2,超過BCG/Ag85A組、BCG/IL-12組和BCG組(P<0.05)，這與小鼠脾淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后的增殖活性一致。IFN-γ能夠激活記憶T細(xì)胞是機(jī)體預(yù)防細(xì)胞內(nèi)病原菌再次感染的基礎(chǔ)，它與IL-2的共表達(dá)對(duì)于抵抗病毒感染從而保護(hù)宿主特別重要[15-16]。而實(shí)驗(yàn)中淋巴細(xì)胞增殖，以及IFN-γ分泌，IL-2在加強(qiáng)免疫后4、6、8周均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在8周時(shí)均持續(xù)在較高水平，說明BCG初免，IL-12作為基因佐劑連同Ag85A DNA疫苗加強(qiáng)的序貫免疫策略,可以產(chǎn)生特異性的Th1型反應(yīng),并且能維持較長(zhǎng)而持續(xù)的記憶反應(yīng)，對(duì)增強(qiáng)免疫原性的作用大于單獨(dú)的BCG免疫和單純使用BCG/DNA或BCG/IL-12的免疫方案。進(jìn)而誘導(dǎo)更持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了BCG的免疫效果，產(chǎn)生比單純BCG更有效的抗結(jié)核桿菌感染的保護(hù)作用。IL-4主要是一種Th2型反應(yīng)的指標(biāo)，雖然從免疫2周開始，BCG/Ag85A組的IL-4水平高于BCG組，Ag85A組(P<0.05)。且其IL-4明顯高于BCG/IL-12組。但加強(qiáng)免疫后IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12組在3個(gè)時(shí)間段均高于其它各組(P<0.05)?？蛇@與IL-2相比，總體水平并不高，進(jìn)一步說明這種聯(lián)合免疫可強(qiáng)化細(xì)胞免疫反應(yīng)，能夠有效的激活小鼠體內(nèi)的Th1型為主的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫原性。同時(shí)，對(duì)于誘導(dǎo)Th2型反應(yīng)及抗體的產(chǎn)生作用較Th1型弱。但免疫效果的增加進(jìn)一步說明了使用這種BCG初免，IL-12聯(lián)合DNA加強(qiáng)的免疫方式優(yōu)于BCG單獨(dú)免疫以及BCG/Ag85DNA或BCG/IL-12聯(lián)合的免疫方式，改善了傳統(tǒng)BCG對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫的刺激作用,使得機(jī)體免疫反應(yīng)向Th1型極化,誘導(dǎo)更明顯和維持時(shí)間更長(zhǎng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

實(shí)驗(yàn)證明,采用BCG初免，細(xì)胞因子IL-12作為基因佐劑聯(lián)合DNA疫苗加強(qiáng)的序貫免疫策略,是對(duì)提高針對(duì)結(jié)核桿菌的疫苗免疫效應(yīng)的一種新嘗試。序貫免疫策略不僅能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答同時(shí)將為耐受現(xiàn)有疫苗BCG的預(yù)防和治療提供一條新的途徑，也將會(huì)對(duì)人類在全世界范圍內(nèi)降低結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率帶來福音。

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