趙 亮，唐秀文，王梅竹，曹 煜，牟麗麗，金 方，李小玲，陳玉如，康穎倩

馬爾尼菲青霉菌 (Penicilliummarneffei，PM)主要侵犯免疫受損的人群，引起馬爾尼菲青霉病(penicilliosis marneffei，PSM)。該病主要在東南亞地區(qū)流行，如泰國、越南、柬埔寨、老撾、香港等，在流行地區(qū)，馬爾尼菲青霉菌病已成為繼結(jié)核病和隱球菌性腦膜炎之后的第三大機會性感染，并已成為東南亞國家HIV感染的指征性疾病[1]。我國以廣西、廣東地區(qū)多見，但近年來，兩廣以外的省份也出現(xiàn)感染病例。為了進一步探索該真菌在不同地區(qū)的分布特點及分子流行病學(xué)特點。本文采用了微衛(wèi)星基因分型法(multilocus microsatellite typing，MLMT)對貴州及廣西、廣東地區(qū)的馬爾尼菲青霉菌臨床株進行了分型和對比研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源 通過貴州省貴陽市傳染病院HIV感染科，廣西壯族自治區(qū)龍?zhí)夺t(yī)院檢驗科，廣州孫逸仙醫(yī)院等從貴州省，廣西省，廣東省各地區(qū)病人血液、皮膚分泌物中分離馬爾尼菲青霉菌菌株共50株，其中貴州省16株，廣西省29株，廣東省5株。

1.2培養(yǎng)基和試劑 PDA培養(yǎng)基(Difco Laboratories)，CTAB(四川金山制藥公司)，PCR試劑盒(Fermentas公司)，Taq-DNA 多聚酶(上海生工)。

1.3菌株分離與形態(tài)學(xué)鑒定 將貴州收集到的標本及獲贈自廣西、廣東的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，劃線法分離純化馬爾尼菲青霉菌，挑取單個菌落傳代保存，分別于25 ℃及37 ℃觀察馬爾尼菲青霉菌的菌絲相及酵母相形態(tài)特點。

1.4DNA提取 將50株馬爾尼菲青霉菌接種于PDA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)物，采用玻璃珠法和CTAB法[2]提取馬爾尼菲青霉菌的DNA，吸光度法檢測DNA濃度，并稀釋成1 μg/μL冷凍備用。

1.5ITS檢測與鑒定 以ITS4、ITS5為引物，用PCR試劑盒在25 μL反應(yīng)體系中擴增，上、下游引物及DNA各1 μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后變性94 ℃ 30 s、退火50 ℃30 s、延伸72 ℃1 min循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min，將產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖中電泳后在紫外燈下觀察，并將擴增產(chǎn)物進行測序。

1.6微衛(wèi)星基因分型

1.6.1引物合成 根據(jù)文獻[3]，選擇具有6個以上二核苷酸重復(fù)單位的微衛(wèi)星位點AL684924 ( PMMI),AL686035 ( PMMII), AL684847 ( PMMIII)，合成引物，每對引物上游5’端用6-羧基熒光素(FAM)標記。

1.6.2微衛(wèi)星序列分析 用合成的3對引物對50株P(guān)M基因組DNA分別進行擴增。50 μL PCR反應(yīng)體系為，DNA模版4 μL，引物0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR緩沖液5 μL，Taq-DNA 多聚酶2.5 U，MgCl22 mmol/L。PCR反應(yīng)條件，96 ℃預(yù)變性4 min，然后變性95 ℃30 s、退火58 ℃30 s、延伸72 ℃30 s循環(huán)35次，最后72 ℃延伸30 min，將產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖中電泳后在紫外燈下觀察。擴增樣品冷凍送于上海生工公司進行毛細管電泳，通過Genescan軟件分析計算等位基因大小。根據(jù)序列長度，分離株可被分為不同基因型。

1.7聚類分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件聚類分析法處理等位基因數(shù)據(jù)，自動生成譜系聚類樹狀示意圖。

2 結(jié) 果

2.1菌株分離與觀察 貴州共分離到16株，以及獲贈自廣西地區(qū)的29株及廣東的5株，共50株馬爾尼菲青霉菌，37 ℃培養(yǎng)72 h形成乳白色酵母型菌落，25 ℃培養(yǎng)72 h形成青綠色絲狀菌落，并產(chǎn)生酒紅色色素(圖1)。

圖1PDA培養(yǎng)基上的馬爾尼菲青霉菌菌落

Fig.1ColoniesofP.marneffeionPDAsolidmedium

a:P.marneffeicolonies (yeast form) growing at 37 ℃ for 72 hours;

b:P.marneffeicolony (filamentous form) growing at 25 ℃ for 72 hours

2.2ITS序列分析 將ITS序列測序結(jié)果在Pubmed 基因庫中搜索對比，鑒定菌種，結(jié)果顯示所收集菌株均為馬爾尼菲青霉菌。

2.3微衛(wèi)星分型 結(jié)果顯示50株馬爾尼菲青霉菌的每個位點均可以觀察到一個簡單的PCR擴增產(chǎn)物，說明培養(yǎng)物中沒有混雜的PM菌株。PCR產(chǎn)物大小用Genescan軟件分析，如圖2所示，藍色主峰即為標記的等位基因大小。

微衛(wèi)星引物PMMI 、PMMII、PMMIII分析檢測到的等位基因見表1，50個樣本共檢測到47個微衛(wèi)星型(PMMT)。貴州檢測到14個型，相同型別的菌株有Gypm2、Gypm3和Gypm15，均屬于PMMT2型；廣州檢測到4個型，相同的有Sums0851、Sums0107,均屬于PMMT18型；廣西檢測到29個型。如圖3A所示，PMMI區(qū)分度最高，共檢測到29個不同大小的等位基因,散在分布于158～245 bp內(nèi)，分布頻率最高的是192 bp和189 bp的等位基因，各有6株(各為12%)，其中含192 bp等位基因的菌株于3個地區(qū)都有分布，而含189 bp等位基因的菌株均來自貴州。PMMII檢測到9個不同的等位基因，分布在148～158 bp之間，如圖3B所示，分布頻率較高的等位基因型是150 bp、149 bp和153 bp,分別有16(32%)、13(26%)和10(20%)株，3個地區(qū)共有的等位基因是148 bp和153 bp。PMIII檢測到8個不同的等位基因，分布在213～225 bp內(nèi)，如圖3C所示，分布頻率最高的是218 bp、216 bp和214 bp，分別有17(34%)、16(32%)和9(18%)株，其中216 bp和218 bp是三個地區(qū)共有的等位基因。

圖2馬爾尼菲青霉菌Sums0851毛細管電泳圖

Fig.2CapillaryelectrophoresispatternsofP.marneffeistrainSums0851

A: PMMI; B: PMM II; C: PMMIII

圖350株馬爾尼菲青霉菌的等位基因在貴州、廣西和廣東地區(qū)的分布特點

Fig.3Alleledistributioncharacteristicsfor50P.marneffeistrainsobtainedfromGuizhou,GuangxiandGuangdong

A: PMMI; B: PMMII; C: PMMIII

表1 PM菌株來源地理區(qū)域、等位基因大小、微衛(wèi)星分型

根據(jù)歐式距離 ( Euclidean distance )[4]可將貴州、廣西、廣東臨床分離的馬爾尼菲青霉菌分為6大類(Cluster1～ Cluster6)，譜系聚類樹狀圖如圖4所示，Cluster1共9株(18%)，包括3株廣東株和6株廣西株；Cluster2共8株(16%)，均為廣西株；Cluster3共27株(54%)，包括13株貴州株、13株廣西株和1株廣東株；Cluster4共3株(6%)，包括1株貴州株和2株廣西株；Cluster5共2株(4%)，為貴州株和廣東株各1株；Cluster6僅1株(2%)貴州株。

圖450株馬爾尼菲青霉菌的聚類分析樹狀圖

Fig.4Phenogramtreeconstructionwith50P.marneffeistrains

Strains named Gypm- obtained from Guizhou; strains named Sums- obtained from Guangxi; strains named Gxpm- and A00- obtained from Guangxi.

3 討 論

馬爾尼菲青霉菌是一種溫度依賴性雙相真菌，在37 ℃生長形成酵母樣菌落，在25 ℃生長形成絲狀菌落，并產(chǎn)生酒紅色色素。竹鼠是該菌的天然宿主，有研究[5]認為竹鼠是該病重要的傳染源，也有[6]推測接觸流行區(qū)的含菌土壤可引起人感染，具體傳播途徑尚待明確。在我國最早以廣西省最多見[7]，近年來，隨著艾滋病的增多，PM引起的感染在云南、北京、福建、四川等省相繼出現(xiàn)報道，且呈上升趨勢。說明我國PM感染逐漸跨越了原來的流行區(qū)域，但相關(guān)分子流行病學(xué)研究尚存不足。早期應(yīng)用于PM分子流行病學(xué)研究的RFLP、RAPD等[8-9]方法，區(qū)分度較低，重復(fù)性較差。目前微衛(wèi)星序列分型法(MLMT)以其高度多態(tài)性和高分辨率被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)和分子流行病學(xué)分析中。Fisher等[10]用23個微衛(wèi)星位點對來自不同流行國家的PM臨床分離株進行分析，提示PM的地區(qū)分布與種群基因結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性。Lasker和Ran等[3]應(yīng)用3個微衛(wèi)星位點對流行地區(qū)PM的相關(guān)研究也獲得相似推論。為進一步了解PM的流行特征，本研究通過對來自我國南方地區(qū)貴州、廣東和廣西的馬爾尼菲青霉菌臨床菌株微衛(wèi)星多態(tài)性研究，以從微生態(tài)遺傳基因?qū)用娼沂驹摼姆肿恿餍胁W(xué)特點及其與地域間的聯(lián)系。

本研究共收集并鑒定了來自貴州、廣西和廣東的馬爾尼菲青霉臨床株50株。AL684924 (PMMI)、AL686035 (PMMII)、AL684847 (PMMIII)3個微衛(wèi)星位點分別檢測到29、9和8種不同大小的等位基因，組合3個基因?qū)?0株P(guān)M分為47個微衛(wèi)星型(PMMT1～PMMT47)。說明貴州、廣西和廣東分布的馬爾尼菲青霉存在著較高的基因多態(tài)性。進一步分析各微衛(wèi)星位點在3個地區(qū)的分布，發(fā)現(xiàn)PMMI集中在158～245 bp之間，分布以189 bp(12%)和192 bp(12%)比例最高，PMMII集中在148～158 bp之間，分布以150 bp(32%)、149 bp(26%)和153 bp(20%)為主，PMMIII集中在213～225 bp內(nèi)，分布以218 bp(34%)、216 bp(32%)和214 bp(18%)為主，對比還發(fā)現(xiàn)3個地區(qū)間微衛(wèi)星位點均存在相同的等位基因分布。而根據(jù)等位基因聚類分析結(jié)果，3個地區(qū)PM臨床株分為6類，其中54%屬于Cluster3，Cluster1和Cluster2分別占18%和16%，Cluster4 、Cluster5 和Cluster6分布較少。以上結(jié)果分析顯示貴州、廣東和廣西的馬爾尼菲青霉微衛(wèi)星型具有一定的地區(qū)分布規(guī)律和相關(guān)性，這可能與貴州、廣東和廣西都位于我國南方地區(qū)，且位置鄰近有關(guān)，本研究結(jié)果再次說明馬爾尼菲青霉的種群基因結(jié)構(gòu)與地域分布之間存在著一定的相關(guān)性。但這種相關(guān)性是否與相鄰地區(qū)間菌株遷徙以及地區(qū)間的疾病傳播有關(guān)，則需擴大樣本量及采樣范圍進一步研究。另外，我們還在同一地區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了相同的微衛(wèi)星型和個別分布比較特殊的等位基因(如含PMMI 189 bp等位基因的菌株均來自貴州)，這是否意味著PM的分布還存在地區(qū)同源性和遺傳差異性，均有待于補充更多標本后進一步研究明確。

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