于 娟，饒華祥，李 紅，盧囡囡，易 虎，趙生倉(cāng)

自1983年以來(lái)，乙型流感病毒按其抗原特性和基因特征分為兩大譜系：Yamagata系和Victoria系[1-2]。同甲型流感毒一樣，乙型流感病毒也是依靠病毒外膜蛋白，特別是血凝素的重鏈HA1基因的變異，改變抗原特性來(lái)逃避抗體已有免疫保護(hù)，從而不斷導(dǎo)致流感的流行[3]。

青海省自2009年甲型H1N1流感疫情爆發(fā)后，乙型流感一直處于低流行水平，直到2011年出現(xiàn)上升趨勢(shì)。本研究首次對(duì)青海省乙型流感分離株HA1基因變異情況進(jìn)行系統(tǒng)研究，以便在分子水平上了解其變異特點(diǎn)和規(guī)律，及時(shí)發(fā)現(xiàn)變異株，為流感流行起到預(yù)警作用。通過(guò)與WHO北半球推薦疫苗株進(jìn)行比較，了解目前疫苗株對(duì)青海省人群的保護(hù)效果，為流感的預(yù)防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本和毒株來(lái)源 采集2011年1月至2012年12月青海省流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的流感樣病例的鼻咽拭子5302份，采用MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)對(duì)流感病毒進(jìn)行鑒定，具體步驟見參考文獻(xiàn)[3]。

1.2病毒RNA提取 采用德國(guó)Qiagen Rneasy Mini Kit(74104)，按照試劑盒中操作手冊(cè)所提供的方法提取病毒RNA。

1.3RT-PCR 使用德國(guó)Qiagen One-step RT-PCR kit (210212)，美國(guó)Promega RNase Inhibitor(277470)，HA1基因RT-PCR上游引物：5’- GAAGGCAATAATTGTACT-3’，下游引物：5’- ACCAGCAATAGCTCCGAA -3’[4](均為大連寶生物公司合成)，加入提取的5 μL RNA模板，參照試劑盒中說(shuō)明書配制成25 μL體系，按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：60 ℃1 min，42 ℃10 min，50 ℃30 min，95 ℃15 min，(94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃1 min)35 cycles，72 ℃10 min。

1.4PCR產(chǎn)物純化及核苷酸序列測(cè)定 使用德國(guó)Qiagen MinElute PCR Purification Kit (28006)對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物采用美國(guó) AB公司BigDye Terminator v1.1 kit (4337450)，參照試劑盒說(shuō)明書配制成20 μL體系，按以下條件進(jìn)行測(cè)序PCR擴(kuò)增：96 ℃1 min，(96 ℃10 s，50 ℃5 s，60 ℃4 min)25 cycles。測(cè)序產(chǎn)物采用Qiagen DyeEx 2.0 Spin Kit (63204)進(jìn)行純化后在ABI3500基因分析儀上進(jìn)行測(cè)序，具體操作方法參照儀器操作說(shuō)明。

1.5序列分析 采用DNA Star 5.0 MegAlign和MEGA 4.0軟件將分離株與近10年WHO推薦的疫苗株、Yamagata 系和Victoria 系代表株以及同期其他地區(qū)分離株進(jìn)行HA1基因特征分析。核苷酸序列采用MEGA 4.0自帶的Clustal W軟件進(jìn)行比對(duì)，NJ法(鄰接法)構(gòu)建基因進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)值設(shè)定為1000，以上序列均來(lái)自GenBank。

2 結(jié) 果

2.1流感毒株流行情況 2011年青海省共分離流感毒株35株，其中Victoria系乙型毒株17株，占48.57%，Yamagata系乙型毒株15株，占42.86%， H3亞型2株，占5.71%，新甲H1亞型毒株1株，占2.86%。2012年青海省共分離流感毒株85株，其中Victoria系乙型毒株34株，占40.00%，Yamagata系乙型毒株3株，占3.53%，H3亞型36株，占42.35%，新甲H1亞型毒株12株，占14.12%?？傮w來(lái)說(shuō)，青海省2011年上半年Yamagata系作為優(yōu)勢(shì)流行株在人群中廣泛流行，下半年活動(dòng)逐漸減弱，12月份Victoria系毒株活動(dòng)逐漸加強(qiáng)，在2012年4月份之前為優(yōu)勢(shì)流行株，之后H3亞型代替Victoria系毒株成為優(yōu)勢(shì)流行株。

2.2血凝素HA1基因進(jìn)化樹分析 從基因進(jìn)化樹可以看出，2011-2012年青海省乙型流感毒株主要分為Victoria系和Yamagata系兩個(gè)進(jìn)化分支，且相同或相近年份分離株聚集成簇。2011年青海省Victoria系乙型分離株B/Qinghaichengdong/1223/2011和B/Qinghaichengzhong/2115/2011與同期廣東分離株親緣關(guān)系較近，B/Qinghaichengdong/1410/2011與2010年廣東、北京、寧波分離株親緣關(guān)系較近，以上毒株與2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，未處于同一進(jìn)化分支；2011年底和2012年的Victoria系乙型分離株與2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008及2012年湖州分離株親緣關(guān)系較近，處于同一分支?？梢钥闯?，所有分離株已逐漸遠(yuǎn)離Victoria系代表株B/Victoria/2/87及以往WHO推薦疫苗株：B/Hongkong/330/2001(2002-2004)和B/Malaysia/2506/2004(2006-2008)。2011年青海省Yamagata系乙型分離株與2011-2012年WHO推薦疫苗株B/Wisconsin/01/2010及同期廣東分離株處于同一分支，親緣關(guān)系較近，但已逐漸遠(yuǎn)離以往Yamagata系代表株B/Yamagata/16/88及以往WHO推薦疫苗株：B/Shanghai/361/2002(2004-2006和B/Florida/4/2006(2006-2008)(見圖1)。

2.3Victoria系分離株HA1基因分析

2.3.1核苷酸同源性分析 本研究測(cè)得Victoria系分離株HA1基因984 bp，青海本地分離株間同源性為85.8%～98.9%，本地分離株與2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008同源性為88.6%～95.7%。

2.3.2核苷酸推導(dǎo)的氨基酸位點(diǎn)差異比較 與2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，2011年青海省Victoria系分離株的氨基酸變異位點(diǎn)有L58P，I146V，N171D，L303I，Y309D，A317S，P322S，其中I146V，N171D位于抗原決定簇；2012年分離株的氨基酸變異位點(diǎn)有N123D，I146V，Q264H，P322S，其中N123D，I146V位于抗原決定簇(見表1)?？梢钥闯觯琁146V變異發(fā)生在所有青海分離株中，其余氨基酸位點(diǎn)變異不具有普遍性，呈散在性分布。糖基化位點(diǎn)分析后，發(fā)現(xiàn)P322S使得分離株在320位增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)。

圖1 乙型流感病毒血凝素HA1 基因進(jìn)化樹

2.3Yamagata系分離株HA1基因分析

2.3.1核苷酸同源性分析 本研究測(cè)得Yamagata系分離株HA1基因990 bp，本地分離株間同源性為97.6%～99.8%，本地分離株與2011-2012年WHO推薦疫苗株B/Wisconsin/01/2010同源性為97.7%～99.3%。

2.3.2核苷酸推導(dǎo)的氨基酸位點(diǎn)差異比較 與2011-2012年WHO推薦疫苗株B/Wisconsin/01/2010相比，2011年青海省Victoria系分離株的氨基酸變異位點(diǎn)有N116K，D196N，D232N，L267V，其中N116K，D196N位于抗原決定簇，發(fā)生在所有青海分離株中，其余位點(diǎn)變異不具有普遍性，呈散在性分布。經(jīng)過(guò)糖基化位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)B/Qinghaidatong/220/2011與疫苗株相比發(fā)生了D232N變異，使其在232位增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)；所有青海分離株均發(fā)生了D196N變異，使分離株在196位增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，位于抗原決定簇。

表1 Victoria系乙型流感毒株HA1基因重要氨基酸變異位點(diǎn)比較

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn)乙型流感病毒僅發(fā)生抗原性漂移，而不發(fā)生像甲型流感病毒那樣的抗原性轉(zhuǎn)變，因此，乙型流感常常在人群中僅引起一些局部和中等程度的流行。盡管流感病毒的抗原性經(jīng)常不斷地發(fā)生變異，但并非所有的變異株都具有流行病學(xué)意義。

表2 Yamagata系乙型流感毒株HA1基因重要氨基酸變異位點(diǎn)比較

乙型流感病毒HA1基因的第70～ 90位和110～ 210位氨基酸參與病毒抗原決定簇的構(gòu)成，此其間氨基酸變異會(huì)導(dǎo)致病毒抗原性改變[4]。作為一個(gè)具有代表性的新變種，它必須在HA1區(qū)蛋白分子上有4個(gè)以上氨基酸序列發(fā)生了替換，而且替換必須涉及到2～3個(gè)抗原決定簇位點(diǎn)[5]。對(duì)2011-2012年青海省分離到的乙型流感毒株HA1區(qū)核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，Victoria系分離株與2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008同源性為88.6%～95.7%，氨基酸替換數(shù)在2～5個(gè)，有1-2個(gè)參與構(gòu)成抗原決定簇。Yamagata系與2011-2012年WHO推薦疫苗株B/Wisconsin/01/2010HA1區(qū)相比較同源性為97.7%～99.3%，氨基酸替換數(shù)在2-3個(gè)，有2個(gè)參與構(gòu)成抗原決定簇?？梢钥闯觯琕ictoria系與Yamagata系分離株均已發(fā)生了一定變異，但尚沒有發(fā)生病毒抗原漂移。值得注意的是Yamagata系分離株均在196位增加了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)的增加或減少對(duì)病毒抗原性及其他生物特性均有一定的影響，尤其發(fā)生在抗原決定簇附近的糖基化會(huì)影響抗體的結(jié)合，我們應(yīng)密切關(guān)注其對(duì)分離株的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，流感疫苗對(duì)人體的免疫保護(hù)效果取決于流行株與疫苗株之間的抗原匹配程度，匹配程度越高，免疫保護(hù)效果越好。由于2009-2011年WHO推薦疫苗株B/Brisbane/60/2008對(duì)2011為Victoria系代表株，青海地區(qū)人群中對(duì)Victoria系流感病毒已形成了一定的免疫屏障，使得2011年初Victoria株的流行減弱，而人群中的Yamagata系病毒株抗體水平較低，使得Yamagata系毒株活動(dòng)逐漸加強(qiáng)，成為優(yōu)勢(shì)流行株，提示B/Brisbane/60/2008對(duì)2011年青海地區(qū)人群沒有起到很好的保護(hù)作用。2011-2012年WHO推薦流感疫苗B/Wisconsin/01/2010為Yamagata系代表株，且與2011年青海Yamagata系分離株親緣關(guān)系較近，能夠?qū)θ巳寒a(chǎn)生較好保護(hù)作用，使得2011年Yamagata系株在下半年流行逐漸減弱，但造成Victoria系株在2011年12月份至2012年4月份活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，成為優(yōu)勢(shì)流行株，這與其他地區(qū)報(bào)道的2011-2012年乙型流感病毒流行趨勢(shì)基本一致[6]。

在免疫系統(tǒng)選擇壓力下，乙型流感病毒必將不斷發(fā)生變異以逃避宿主體內(nèi)已有抗體的免疫保護(hù)，其在下一個(gè)流行季節(jié)會(huì)發(fā)生怎樣的基因變異，還有待進(jìn)一步的流感監(jiān)測(cè)工作及基因特性分析，需加強(qiáng)流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的乙型流感病毒變異株。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rota PA, Wallis TR, Harmon MW, et al. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza B virus since 1983[J]. Virology, 1990, 175(1): 59-68.

[2]Kanegae Y, Sugita S, Endo A, et al. Evolutionary pattern of the hemagglutinin of influenza B virus isolated in Japan: cocirculating lineages in the same epidemic season [ J]. J Virol, 1990, 64(6): 2860-2865.

[3]Guo YJ, Cheng XW. Influenza virus and experimental technology[M]. Beijing: China Three Gorges Press, 1997: 42-102. (in Chinese)

郭元吉, 程小雯. 流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京:中國(guó)三峽出版社, 1997：42-102.

[4]WHO.WHO information for molecular diagnosis of influenza virus in humans- update[EB/OL].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/molecular_diagnosis/en/, 2013-04-15/2013-07-01.

[5]He C, Zhang L, Entomack B, et al. Distribution of Influenza B virus and characterization of HA1 segment in Beijing during 2009-2010[J]. Chin Prev Med, 2010, 11(10): 995-999. (in Chinese)

何翠, 張磊, 恩特馬克·布拉提白,等. 北京地區(qū)2009-2010 年乙型流感病毒的流行特征及HA1 基因片段特性分析[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 11 (10): 995-999.

[6]Huang WJ, Tan MJ, Lan Y, et al. Virologic characterization of influenza B virus in Mainland China during 2011-2012 [J]. Chin J Virol, 2013, 29(1): 32-38. (in Chinese)

黃維娟, 譚敏菊, 藍(lán)雨, 等. 2011-2012年度中國(guó)B型流感病毒病原學(xué)特征分析[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2013, 29 (1): 32-38.