熊浩明，魏柏青，祁美英，李存香，楊曉艷，辛有全，魏榮杰，靳 娟，代瑞霞

青海省位于青藏高原東北部，東經(jīng)89°35′～103°04′，北緯31°40′～39°19′，東西長1 200 km，南北寬800 km，面積72.12萬km2。屬于高原大陸性氣候，具有氣溫低、晝夜溫差大、降雨少而集中、日照長、太陽輻射強等特點。有喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地和青海田鼠鼠疫自然疫源地2種類型的疫源地，是我國鼠疫危害最嚴重的地區(qū)之一。不同類型的鼠疫自然疫源地由于地理分布、主要宿主動物以及鼠疫菌的生化性狀不同,鼠疫菌的毒力也存在差異。本文對青海省分離的392珠鼠疫菌進行毒力測定，并輸入青海省地方病防治地理信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫，用QHEndem ic-GIS軟件對青海省392株鼠疫菌毒力的空間分布進行描述和分析，以便為青海省鼠疫防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1菌株來源 以1954-2012年青海省內(nèi)不同地區(qū)、宿主、媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌392株作為實驗對象。所有菌株均由青海省國家鼠疫菌種保藏中心提供。

1.2實驗動物 昆明系小白鼠(以下簡稱小鼠), 體重18～20 g，購自青海省實驗動物中心。

1.3毒力測定 將每株菌的37 ℃24 h培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水制成菌懸液，菌懸液原液濃度大于20億個菌/mL，用標準比濁管比濁稀釋成7億個菌/mL，計算制成的菌懸液原液的實際濃度，稀釋為2×101個菌/mL、2×102個菌/mL、2×103個菌/mL、2×104個菌/mL、2×105個菌/mL、2×106個菌/mL、2×107個菌/mL、2×108個菌/mL、2×109個菌/mL。劑量組小鼠皮下注射0.5 mL，每組5只，攻毒劑量為101個菌、102個菌、103個菌、104個菌、105個菌、106個菌、107個菌、108個菌、109個菌。同時用100個菌接種平皿，28 ℃培養(yǎng)72 h計算其活菌數(shù)。小鼠觀察飼養(yǎng)14 d，死亡的小鼠當天解剖，取肝、脾做細菌培養(yǎng)和鼠疫噬菌體裂解試驗，培養(yǎng)出鼠疫菌者為特異性死亡，否則為非特異性死亡。用SPSS 21.0軟件計算每株鼠疫菌對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)和95%的可信范圍[1]。

1.4QHEndem ic-GIS數(shù)據(jù)庫的建立和制圖 將每株鼠疫菌分離的宿主、媒介、分離地點、地理編碼、輸入數(shù)據(jù)庫。用QHEndem ic-GIS軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)后，用青海省地圖按照不同的制圖要求進行參數(shù)字段分類并賦予相應(yīng)的顏色顯示，插入圖例和標題后輸出。

2 結(jié) 果

2.1毒力測定結(jié)果及空間分布 青海省392株鼠疫菌對小鼠毒力測定結(jié)果：LD50小于100的菌株有323珠，占82.39%；LD50大于等于100小于1 000的菌株有44珠，占11.22%；LD50大于等于1 000小于10 000的菌株有10珠，占2.55%；LD50大于等于10 000的菌株有15珠，占2.55%。其中LD50大于等于1億的菌株有5珠，占1.27%，分布于共和縣、興?？h、格爾木市和都蘭縣，分離宿主為人尸體、喜馬拉雅旱獺和五趾跳鼠。青海省各地區(qū)392珠鼠疫菌對小鼠LD50結(jié)果見表1，LD50小于1 000的強毒菌有367株占測毒數(shù)量的93.62%。將測毒數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫后用QHEndem ic-GIS軟件對鼠疫菌LD50小于100和小于1 000的菌株數(shù)空間分布圖見圖1、2。

2.2青海省鼠疫菌不同生態(tài)型毒力 青海省各地區(qū)392株鼠疫菌按照不同生態(tài)型(生態(tài)型分類依據(jù)文獻[2])菌株分類統(tǒng)計LD50結(jié)果見表2，將青藏高原型菌株和祁連山型菌株的LD50數(shù)據(jù)輸入SPSS21.0，用SPSS 21.0計算青藏高原型菌株LD50分布為正態(tài)分布，均數(shù)為166458.224，標準差為2626588.49；祁連山型菌株LD50分布為正態(tài)分布，均數(shù)為81.785，標準差為294.19。用SPSS 21.0做兩獨立樣本秩和檢驗，檢驗類型選擇“Mann Whitney U”Z值為-1.687，P<0.01，故認為兩種生態(tài)型菌株LD50間有顯著性差異。青海田鼠型和其他生態(tài)型菌株因抽樣比例較少未做LD50比較。

圖1LD50小于100的鼠疫菌株空間分布

Fig.1SpatialdistributionofLD50<100Yersiniapestisstrains

圖2LD50大于等于100小于1000鼠疫菌株空間分布

Fig.2Spatialdistributionof100≤LD50<1000Yersiniapestisstrains

3 討 論

鼠疫菌與其他病原微生物一樣, 不同疫源地的鼠疫菌的毒力有明顯的差異, 因此, 毒力也作為鼠疫菌分型的一個重要指標[3]。張春華等[4]指出以往工作中鼠疫菌毒力測定中存在概念混淆，將LD100誤說為MLD[4]，推薦更加適用的半數(shù)致死量(LD50)計算方法[4]。朱錦沁等[5]用小鼠對鼠疫菌毒力的劃分為：MLD在1萬或l萬以下為強毒菌，MLD大于1萬小于10萬為中等毒力菌，100億菌尚不能完全致死小白鼠的為自然弱毒菌，這是對鼠疫菌毒力最早的劃分。黃堅華等[6]參考我國生物制品規(guī)定中鼠疫菌安全生產(chǎn)試驗標準，將我國的鼠疫菌的毒力分為4種類型，即強毒株、中等毒株、低毒株和弱毒株。目前關(guān)于鼠疫菌毒力的劃分還沒有統(tǒng)一的標準，應(yīng)按照LD50確定鼠疫菌的毒力劃分較為準確。按照青海省392株鼠疫菌對小鼠毒力測定結(jié)果，LD50小于1 000的鼠疫菌株應(yīng)劃分為鼠疫強毒株，占93.62%(367/392)；LD50大于等于1 000小于10 000的鼠疫菌株為鼠疫中等毒力株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于10 000小于1億的鼠疫菌株為鼠疫低毒株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于1億的鼠疫菌株為弱毒株，占1.27%(5/392)。本次試驗發(fā)現(xiàn)毒力變異的弱毒株5株，有1株分離于人尸體中，1株分離于五趾跳鼠，3株分離于喜馬拉雅旱獺。王麗[7]等在青?！叭础钡貐^(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分在疫源地居住的居民進入疫源地務(wù)工及捕食旱獺的人員血清存在鼠疫抗體，血清抗體滴度普遍不高。浙江、廣西、廣東、河北、陜西、青海等省市均發(fā)現(xiàn)健康人群鼠疫F1抗體陽性情況[7-12]，本次毒力測定過程中發(fā)現(xiàn)5株鼠疫菌半數(shù)致死量大于1億，這或許應(yīng)成為健康人群血清存在鼠疫抗體的一個研究方向。不同生態(tài)類型疫源地的菌株毒力存在明顯的差異，本次毒力測定發(fā)現(xiàn)祁連山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力強，兩者菌株LD50有顯著性差異。青海田鼠型因地區(qū)局限，分離菌株數(shù)量少，本次研究抽樣較少，未做LD50比較。

表1 青海省各地區(qū)392株鼠疫菌對小鼠LD50結(jié)果

表2 青海省各地區(qū)392株不同生態(tài)型鼠疫菌對小鼠LD50結(jié)果

從圖上可以看出，青海省鼠疫菌絕大多數(shù)屬于鼠疫強度株，鼠疫強毒株分布覆蓋了青海省大部分面積。青海省鼠疫以強毒株為主，鼠疫病型易由腺鼠疫轉(zhuǎn)化為肺鼠疫，應(yīng)進一步加強動物鼠疫監(jiān)測，防止人間鼠疫發(fā)生。建立青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可供其他學(xué)者后續(xù)研究參考。

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