趙志鴻 耿 楠 黃勇勇 吳 芳 李錦玉 王桂芳 張壯麗 張小俊

1.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州 450052；2.河南省肝病藥理重點實驗室，河南鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001；4.鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，河南鄭州 450001

艾葉為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉，全國各地區(qū)均產(chǎn)，資源豐富。 現(xiàn)代研究顯示，其主要含有揮發(fā)油、甾萜類、黃酮類、香豆素類、多糖及一些小分子成分等[1-3]，其中揮發(fā)油、黃酮類為主要有效成分[4-6]。艾葉是我國歷史悠久且臨床常用的中藥材[7]，有溫經(jīng)止血、散寒止痛、降濕殺蟲等[8]功效，現(xiàn)代實驗表明其具有增強免疫抗感染、平喘鎮(zhèn)咳、護肝利膽、止血與抗凝血及抗自由基等作用[9-11]，揮發(fā)油是艾葉的主要藥效成分群之一，提取方法和工藝是揮發(fā)油質(zhì)量和藥理活性的保證，對于艾葉資源的開發(fā)利用也具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油具有抗乙肝病毒作用，并對其化學(xué)成分進行了分析[12]，為將其研制成抗乙肝病毒新藥，研究揮發(fā)油的提取工藝。水蒸氣蒸餾法適合工業(yè)生產(chǎn)推廣，環(huán)保、經(jīng)濟。 本文以正交試驗法[13-14]對艾葉揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝進行優(yōu)化， 可提高揮發(fā)油的收率和質(zhì)量，降低成本，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

艾葉產(chǎn)地河南省駐馬店，由河南省中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥葉。使用時粉碎使通過二號至三號篩，混合均勻。

1.1.2 儀器及試劑

揮發(fā)油提取器 （相對密度小于1 型）；KDM-4 型電子可調(diào)自動恒溫儀（山東菏澤市儀器制刷廠制造）；電子天平AR1530（梅特勒-托利多儀器上海有限公司制造）；蒸餾水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 艾葉揮發(fā)油的提取方法

參照《中國藥典》2010 年版一部附錄ⅩD 揮發(fā)油測定法（甲法）[15]。 取粉碎的艾葉約100.00 g，精密稱定，加蒸餾水適量，浸泡，加熱提取，收集揮發(fā)油，計算揮發(fā)油得率，密封，冷藏保存。艾葉揮發(fā)油得率計算公式：揮發(fā)油得率（%）＝A/B×100%。

1.2.2 單因素試驗

分別考察料液比、浸泡時間和提取時間對艾葉揮發(fā)油得率的影響。

1.2.2.1 料液比的影響 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，浸泡2 h，提取3 h，各條件分別平行3次，考察不同的料液比下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.2.2 浸泡時間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡時間分別取：0、1、2、4、6 h，提取3 h，各條件分別平行3 次，考察不同的浸泡時間下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.2.3 提取時間的影響 取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，加蒸餾水，料液比（W/V）1∶12，浸泡2 h，提取時間分別為：1、2、3、4、5 h， 各條件分別平行3 次，考察不同的提取時間時下葉揮發(fā)油的得率。

1.2.3 正交試驗及最優(yōu)提取條件的驗證

1.2.3.1 因素水平設(shè)計 由單因素試驗結(jié)果選擇考察因素為提取時間（A）、料液比（B）和浸泡時間（C），各因素分別設(shè)3 個水平，考察指標(biāo)為揮發(fā)油得率，設(shè)計三因素三水平的正交試驗。 見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.3.2 正交試驗設(shè)計 取粉碎的艾葉約100 g， 精密稱定，按表2 設(shè)計的L9（34）正交表進行試驗。

1.2.3.3 最優(yōu)工藝條件驗證試驗 以優(yōu)選出的提取條件進行試驗，重復(fù)3 次，以RSD 值小于5%為必要條件，確定優(yōu)化條件下艾葉揮發(fā)油的得率。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析[16-17]，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)比較，采用t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 L9（34）正交試驗表

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比的影響

料液比（W/V）分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16時，對應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.350±0.017）%、（0.424±0.013）%、（0.421±0.016）%、（0.414±0.021）%、（0.408±0.014）%，二者關(guān)系見圖1。

圖1 料液比與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖1 試驗結(jié)果看出：在浸泡2 h、提取時間為3 h 的提取條件下， 料液比各水平間的揮發(fā)油得率由高到低依次為：1∶10＞1∶12＞1∶14＞1∶16＞1∶8。料液比為1∶10 時得率最高，為（0.424±0.013）%，與料液比1∶8 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），而與1∶12、1∶14、1∶16 之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），即料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 對揮發(fā)油的得率并無太大影響，但由于料液比在1∶10、1∶12 時揮發(fā)油得率較高，且綜合考慮工業(yè)生產(chǎn)成本，選擇正交試驗中料液比的各水平為1∶10、1∶12、1∶14。

2.1.2 浸泡時間的影響

浸泡時間分別為：0、1、2、4、6 h，對應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.343±0.021）%、（0.378±0.014）%、（0.425±0.013）%、（0.417±0.012）%、（0.365±0.022）%， 二者關(guān)系見圖2。

圖2 浸泡時間與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖2 試驗結(jié)果看出：料液比1∶12、提取時間為3 h 的提取條件下， 依艾葉揮發(fā)油得率高至低順序的浸泡時間為：2 h＞4 h＞1 h＞6 h＞0 h。 艾葉經(jīng)浸泡后提取較不浸泡揮發(fā)油得率提高。 其中浸泡2 h 的得率最高，為（0.425±0.013）%，約高于不浸泡時得率的23.91%，與浸泡4 h 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），浸泡時間超過4 h 后，揮發(fā)油得率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），浸泡1、2、4 h 揮發(fā)油得率較高。 因此，在正交試驗中浸泡時間水平選擇為1、2、4 h。

2.1.3 提取時間的影響

提取時間分別為1、2、3、4、5 h， 對應(yīng)的揮發(fā)油得率依次為：（0.312±0.012）%、（0.365±0.019）%、（0.412±0.014）%、（0.418±0.014）%、（0.420±0.016）%， 二者關(guān)系見圖3。

圖3 提取時間與揮發(fā)油得率的關(guān)系

由圖3 試驗結(jié)果看出：在料液比1∶12、浸泡時間為2 h 的條件下，提取時間各水平間的揮發(fā)油得率由高到低依次為：5 h＞4 h＞3 h＞2 h＞1 h。 揮發(fā)油得率隨著提取時間的增加而增加， 提取時間由1 h 增至3 h時，得率由（0.312±0.012）%增至（0.412±0.014）%，增加約32.05%，且3、4、5 h 得率顯著增加，與2 h 比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。 3 h 后得率間的增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），5 h 比3 h 僅增加約1.94%，綜合考慮成本，正交試驗中提取時間選擇1、2、3 h 三個水平。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表3， 利用正交試驗軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 L9（3）4 正交試驗結(jié)果與分析

表4 方差分析表

由表3 得知，RA＝0.096、RB＝0.007、RC＝0.021 各因素主次順序為A＞C＞B，即直觀分析：A 是最重要因素，對結(jié)果影響最大，其次是C，B 是最次要因素。 方差分析結(jié)果表明： 對艾葉揮發(fā)油得率的影響，A 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），B 和C 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。 兩者結(jié)果一致，提取時間是艾葉揮發(fā)油得率的主要影響因素。

根據(jù)揮發(fā)油提取條件的優(yōu)選原則， 由表3 可知：kA3＞kA2＞kA1，kB1＞kB3＞kB2，kC3＞kC2＞kC1確定艾葉揮發(fā)油的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3，即料液比選擇1∶10，浸泡4 h，提取3 h。

2.2.2 驗證試驗

由表5 結(jié)果顯示，在優(yōu)選的提取條件下，艾葉揮發(fā)油平均得率為0.416%，RSD=2.64%（n=3）， 實驗重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

表5 最優(yōu)提取工藝（A3B1C3）下的驗證試驗

3 討論

通過單因素試驗考察并選擇正交試驗各因素水平，用正交試驗對艾葉揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取工藝進行了優(yōu)選， 對優(yōu)選出的最佳工藝條件進行了驗證，證明重復(fù)性好，方法可行，結(jié)果可靠。

揮發(fā)油常見的提取方法有水蒸氣蒸餾法、 微波法、溶劑回流法、超臨界流體萃取法等，其中水蒸氣蒸餾法是分析植物中揮發(fā)性成分的傳統(tǒng)提取技術(shù)，操作簡便、效率較高，適合工業(yè)生產(chǎn)推廣，環(huán)保、經(jīng)濟[18-19]。

以水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油時，揮發(fā)油由水介質(zhì)慢慢浸出，隨水蒸氣蒸出，因此應(yīng)適當(dāng)選擇艾葉與水的比例。水量少時，水散作用進行不徹底，艾葉不能被充分浸泡，蒸氣量生成的就少，得油率將受到影響，試驗中當(dāng)料液比為1∶8 時，上述原因使得揮發(fā)油得率不高；料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 時，揮發(fā)油得率較高，分析原因可能是水量增大，水與揮發(fā)油兩者的接觸界面濃度差增大，更利于揮發(fā)油的擴散和溶解，從而使傳質(zhì)速率得到提高；若加水量過多，會增加耗能，從而使工業(yè)生產(chǎn)成本增加，因此試驗中料液比的水平為1∶10、1∶12、1∶14。

艾葉揮發(fā)油得率隨提取時間的增加而增加，3 h前揮發(fā)油得率增加明顯，3 h 后得率增加緩慢，與艾葉揮發(fā)油不斷蒸出后含量的減少有關(guān)。

艾葉是我國傳統(tǒng)中藥，揮發(fā)油是其諸多藥理活性的主要有效成分群，艾葉揮發(fā)油質(zhì)量的穩(wěn)定是其藥理活性的保證，因此其提取工藝的研究具有應(yīng)用價值[20-21]，尤其水蒸氣蒸餾法提取，環(huán)保、經(jīng)濟，適合推廣。

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