劉楊 ，郭沛涌 ，魯貝貝 ，黃偉 ，萬禁禁

(1. 華僑大學 化工學院，環(huán)境科學與工程系，福建 廈門，361021；2. 華僑大學 環(huán)境與資源技術(shù)研究所，福建 廈門，361021)

近年來，水體富營養(yǎng)化及其引發(fā)的水華問題日益嚴峻，水體的景觀和生態(tài)功能受到嚴重影響[1]。在眾多治理水華的研究中，利用化感作用抑制藻類的生長因其可生物降解性和生態(tài)安全性而日益受到重視。化感物質(zhì)是化感作用的載體，酚酸類物質(zhì)是活性較強的一類化感物質(zhì)[2]，其中水楊酸、沒食子酸和兒茶酚普遍存在于多種植物的化感物質(zhì)中，在較低濃度就有較強的化感作用，許多國外學者已經(jīng)將其分離并且研究了它們對藻類和其他植物的抑制作用[3-4]。Kamaya等[5-7]的研究結(jié)果表明水楊酸對幾種綠藻具有明顯的抑制效果。Wang 等[8]證明沒食子酸等化感物質(zhì)對銅綠微囊藻的生長有明顯的抑制作用。但是，這些研究都是在模擬水體環(huán)境中直接投放酚酸類化感物質(zhì)，容易造成局部濃度太高而對其他生物造成嚴重影響，并且抑藻的有效時間也較短。因此，利用具有緩釋功能的抑藻劑來控制水華藻類生長，可能成為治理水華更有效的方法。殼聚糖(Chitosan)是自然界唯一的堿性多糖，并且是一類資源豐富、可生物降解的天然聚合物[9]。梁想等[10]利用甲殼素、殼聚糖等生物載體吸附水溶液中銅離子后對赤潮生物的殺滅和控制作用，避免了直接投加硫酸銅產(chǎn)生的局部濃度高而傷害魚類的缺點。陳玉成等[11]以殼聚糖作載體合成緩釋性的殼聚糖載銅滅藻劑，能有效控制蛋白核小球藻的生長，且隨著滅藻劑用量增加，滅藻率增大。同時，殼聚糖作為吸附劑，對于水中重金屬和砷等有害物質(zhì)的去除以及凈化水質(zhì)也有了較多的研究[12-14]。綜上所述，酚酸類化感物質(zhì)作為抑制劑在抑藻作用機理方面已經(jīng)有了一定研究，但是還存在抑藻物質(zhì)濃度分部不均和持續(xù)時間不足的問題，而以殼聚糖吸附化感物質(zhì)制備的抑藻劑還未見報道。因此，本文作者以殼聚糖對3 種化感物質(zhì)水楊酸、兒茶酚和沒食子酸的吸附能力研究為切入點，篩選出吸附質(zhì)量比和吸附率較高的組合，制備經(jīng)濟高效的抑藻劑。利用抑藻劑對水華微囊藻進行長期的抑制實驗，并以蛋白核小球藻作為對比，從而為高效、安全的控制藻類生長繁殖，防止和治理水華爆發(fā)提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)(FACHB-1028)為水華藻種并且釋放藻毒素，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)(FACHB-9)為蛋白資源藻種，這2 種藻均購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，并且分別使用指定培養(yǎng)基：BG11 培養(yǎng)基和Bristol 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。實驗前將對數(shù)期的藻種接種到裝有400 mL 新配培養(yǎng)基的 1 L 的錐形瓶中培養(yǎng)，待藻細胞密度達到對數(shù)生長期時分裝到100 mL 經(jīng)過滅菌的空錐形瓶中，穩(wěn)定1 d 后進行后續(xù)實驗。培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光暗比為12 h:12 h，每天搖動3 次，并隨機調(diào)換位置，盡量使各瓶的光通量保持一致以減小偶然誤差。

殼聚糖和兒茶酚(鄰苯二酚)購自國藥集團化學試劑有限公司，水楊酸購自廣東汕頭市西隴化工，沒食子酸購自華邁科。殼聚糖脫乙酰度＞80%，兒茶酚、水楊酸和沒食子酸均為分析純。

1.2 殼聚糖對3 種酚酸類化感物質(zhì)吸附能力研究

利用紫外分光光度計掃描水楊酸、兒茶酚和沒食子酸3 種酚酸的吸收光譜，檢測出吸收峰，然后繪制濃度吸光度相關(guān)的標準曲線。取0.05 g 殼聚糖分別加入20 mL 初始濃度為100，200，300，400，500，600，800，1 000，1 200 和1 500 mg/L 的3 種酚酸溶液中，然后在25 ℃水浴恒溫振蕩l h 后濾后，在相應(yīng)波長下測定其吸光度計算溶液中未被吸附的酚酸的濃度，并計算酚酸類物質(zhì)和殼聚糖的吸附比和吸附率。吸附結(jié)果如下：殼聚糖對沒食子酸的吸附率最高，沒食子酸濃度為1 000 mg/L 時，吸附率可以達到85.7%，對應(yīng)吸附比為491 mg/g。殼聚糖對水楊酸和兒茶酚的最高吸附率分別為43.3%和14.5%，對應(yīng)吸附比分別為138 mg/g 和46 mg/g，吸附效果相對較差，所以選取沒食子酸進行后續(xù)實驗。

1.3 殼聚糖載沒食子酸抑藻劑的制備

分別研究沒食子酸溶液初始濃度、殼聚糖初始用量、吸附時間和溫度等單因子條件下殼聚糖對沒食子酸吸附效果的影響，以此為基礎(chǔ)，設(shè)計正交試驗，利用殼聚糖對沒食子酸的吸附率和吸附比作為響應(yīng)指標，進行因子重要性排序，并找出吸附比較高的最優(yōu)組合。

1.4 抑藻劑對沒食子酸解析能力分析

在最優(yōu)條件下合成殼聚糖載沒食子酸后，過濾并將沉淀在25 ℃下真空干燥24 h 即制得抑藻劑。在100 mL 蒸餾水的錐形瓶中分別加入抑藻劑，使其濃度為6，10，20，30，60，90 和130 mg，在與藻類培養(yǎng)相同條件下，于0.2，1，3，10，24 和48 h 吸取上清液，過0.45 μm 濾膜后測定吸光度，計算沒食子酸含量，以研究殼聚糖載沒食子酸抑藻劑用量對沒食子酸釋放的影響。

1.5 殼聚糖、沒食子酸和抑藻劑對2 種淡水微藻生長的影響

根據(jù)抑藻劑中殼聚糖與沒食子酸的比例，設(shè)置m(殼聚糖):m(沒食子酸):m(抑藻劑)為2:1:3。(1) 直接投加相應(yīng)質(zhì)量物質(zhì)分別到100 mL 處于對數(shù)期的水華微囊藻液中(葉綠素a 含量為1 000 μg/L 左右)，設(shè)置最終質(zhì)量濃度分別4，6，14，20，40，60 和87 mg/L 的殼聚糖處理組，2，3，7，10，20，30 和43 mg/L 的沒食子酸處理組和6，10，20，30，60，90 和130 mg/L的抑藻劑處理組，60 mg/L 的沒食子酸為相對抑藻劑抑制時間做的對照，空白對照組為ck，每組設(shè)置3 個平行樣，每隔1 d 測量一次葉綠素a 的含量。(2) 直接投加相應(yīng)質(zhì)量物質(zhì)分別到100 mL 處于對數(shù)期的蛋白核小球藻液中(葉綠素a 含量為1 000 μg/L 左右)，設(shè)置最終質(zhì)量濃度分別為4，6，14，20，30，40 和60 mg/L的殼聚糖處理組，2，3，7，10，15，20，30 和43 mg/L的沒食子酸處理組和6，10，20，30，45，60，90 和130 mg/L 的抑藻劑處理組，空白對照組為ck，每組設(shè)置3 個平行樣，每隔2 d 測量一次葉綠素a 的含量，以抑制率為響應(yīng)指標，觀察抑藻劑用量隨時間變化對滅藻效果的影響。

抑藻劑的藥效期，一般考慮在加入15 d 后藻細胞不再增長時，藥效期為長；加入抑藻劑后15 d 內(nèi)藻細胞又開始增長時，則藥效期較短[15]。持續(xù)觀測15 d 內(nèi)抑制率的變化，確定抑藻劑長效抑藻的有效用量。

由于抑藻劑、殼聚糖在藻液中成為懸浮顆粒，無法通過吸光度來表征藻類的生長情況，并且傳統(tǒng)血細胞計數(shù)板計數(shù)法存在人為誤差較大，而葉綠素是藻類進行光合作用的條件之一，關(guān)乎藻類是否能夠順利通過光合作用積累有機物和生長繁殖。葉綠素a 屬于葉綠素的一種，其含量的高低可反映出藻細胞進行光合作用的速率以及藻類生長情況，并且藍藻和綠藻中都存在葉綠素a，因此，可以通過測定葉綠素a 含量來評價抑藻劑、沒食子酸和殼聚糖對2 種藻類的影響。葉綠素 a 含量采用浮游植物分析儀(Phyto-PAM Phytoplankton Analyzer，德國walz 公司)進行測定，測定方法參見文獻[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

(1) 殼聚糖對沒食子酸的吸附量公式如下

式中：Q 為對沒食子酸的吸附量(mg)；ρ原為初始沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)；ρ殘吸附后溶液中殘余的沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)；V 為沒食子酸溶液體積(mL)。

(2) 殼聚糖對沒食子酸的吸附比公式如下：

式中：P 為殼聚糖對沒食子酸的吸附比(mg/g)；m 為投加殼聚糖的質(zhì)量(g)。

(3) 抑藻率的計算公式為：

式中：I 為抑制率；ρ對照組為對照組葉綠素含量(μg/L)；ρ處理組為處理組葉綠素含量(μg/L)。

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，利用Origin8.0 進行作圖。葉綠素a 含量采用重復測量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖載沒食子酸抑藻劑的制備

殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的單因子試驗結(jié)果表明：當沒食子酸濃度為變量時，吸附比隨著沒食子酸始濃度的升高而增加，增加速度先快速再趨于平緩，吸附率變化范圍較大，并且在沒食子酸質(zhì)量濃度1 000 mg/L時達到最大值85.76%；當殼聚糖用量為變量時，吸附比變化較大，并隨著殼聚糖用量的增加而逐漸降低，吸附率先快速上升，在0.06 g 時取得最大值86.12%，而后緩慢降低到81.48%，這可能是由于殼聚糖過多，震蕩力不足而使殼聚糖在溶液中相互影響而造成的；當吸附溫度為變量時，吸附量隨著溫度的升高而降低，最佳吸附溫度為25 ℃；當吸附時間為變量時，吸附量隨著時間延長而增加，前30 min 增長速率快，而后增速減緩。

正交試驗結(jié)果如表1 所示，在本實驗范圍內(nèi)，以吸附比和吸附率為響應(yīng)指標，首先考慮吸附比較大的組合3 和4，再考慮到組合3 的吸附率很低只有25.24%，而組合4 的吸附率較高，為51.94%，因此選擇組合4 為最佳吸附組合。殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的最優(yōu)條件為：20 mL 沒食子酸溶液中殼聚糖用量是0.02 g，溫度為25 ℃，吸附時間為60 min，沒食子酸初始質(zhì)量濃度為1 200 mg/L，在該條件下可獲得623.095 mg/g 的吸附比。

吸附后濾液的循環(huán)使用：根據(jù)最佳吸附條件制備的殼聚糖載沒食子酸抑藻劑，其濾液中殘余的沒食子酸質(zhì)量濃度為659.6 mg/L，此時濾液體積約為100 mL，再向濾液中溶解54.04 mg 的沒食子酸可使溶液質(zhì)量濃度達到1 200 mg/L，則可作為抑藻劑的原料，使濾液循環(huán)利用。但是沒食子酸在水中溶解氧存在情況下，易自養(yǎng)化生成物質(zhì)可能會對吸附造成影響。在擴大抑藻劑制備時，需要進一步實驗論證濾液的重復使用次數(shù)。

表1 殼聚糖吸附?jīng)]食子酸實驗正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results of adsorption capacity of Gallic acid by CTS

2.2 抑藻劑對沒食子酸解析能力

不同抑藻劑的用量對沒食子酸量釋放后濃度的影響，如圖1 所示，抑藻劑質(zhì)量濃度分別為6，10，20，30，60，90 和130 mg/L 時，在投加初期釋放濃度上升趨勢較快，釋放率在24 h 時達到最大值，分別為79.26%，90.80%，70.44%，84.34%，59.43%，48.46%和43.56%。隨著抑藻劑投加質(zhì)量增加，沒食子酸釋放濃度逐漸升高，釋放率呈現(xiàn)整體降低的趨勢，這說明溶液中溶解的沒食子酸阻礙了抑藻劑中沒食子酸的釋放，當吸附與解析到達動態(tài)平衡時，沒食子酸濃度穩(wěn)定；當溶液中沒食子酸自氧化之后，抑藻劑會釋放一部分沒食子酸，而達到新的平衡。此外，抑藻劑投加于水體之后，會浮于水面，釋放時間足夠其較均勻的分布，不會造成局部濃度過高。

圖1 殼聚糖載沒食子酸抑藻劑的用量對解吸的影響Fig.1 Effect of dosage of CTS-GA on desorption

2.3 殼聚糖、沒食子酸和抑藻劑對水華微囊藻生長的影響

殼聚糖對水華微囊藻的影響如圖2(a)和(b)所示。可見，處理組與對照組沒有表現(xiàn)出顯著差異(p＞0.05)。殼聚糖呈粉末狀態(tài)并且在培養(yǎng)過程中沒有經(jīng)過長時間的震蕩培養(yǎng)，所以殼聚糖對藻類的絮凝作用表現(xiàn)不明顯。不同質(zhì)量殼聚糖的抑藻率在20%內(nèi)波動，表現(xiàn)出較弱的抑制作用。這表明殼聚糖對藻類的生長影響不明顯，藻類的生長對殼聚糖沒有投加量的依賴性。

沒食子酸對水華微囊藻的影響如圖2(c)和(d)所示?？梢姡种坡孰S沒食子酸質(zhì)量濃度的升高而升高。當沒食子酸質(zhì)量濃度為2，3 和7 mg/L 時，抑制作用相對較弱；當沒食子酸質(zhì)量濃度為10，20 和30 mg/L時，抑制率隨時間的延長而逐漸減弱，無法進行長效抑藻；當沒食子酸質(zhì)量濃度為43 mg/L 時，2 d 后抑藻率可達90%以上，持續(xù)到到觀測的第16 d 抑藻率仍能維持在接近100%，但是16 d 之后，葉綠素a 含量表現(xiàn)出上升趨勢，說明沒食子酸在該使用濃度下，于16 d后被消耗分解，濃度不足以抑制藻類生長而表現(xiàn)出藻類恢復生長的趨勢；當沒食子酸質(zhì)量濃度為60 mg/L，抑制時間在略早于24 d時，藻類表現(xiàn)出恢復生長趨勢，這說明高濃度的投加量仍不適合進行長期抑藻。

圖2 CTS，GA 和CTS-GA 對水華微囊藻生長的影響Fig.2 Effects of CTS, Gallic acid and CTS-Gallic acid on growth of Microcystis flos-aquae

抑藻劑對水華微囊藻的抑制效果如圖2(e)和(f)所示?？梢?，抑制效率隨抑藻劑使用濃度的升高而升高。6 mg/L 的抑藻劑處理組與對照組ck 相比差異性不顯著(p＞0.05)，其他濃度處理組能顯著(p＜0.05)抑制微囊藻的生長。當抑藻劑質(zhì)量濃度為10 和20 mg/L 時，抑藻率先升高后降低，不能有效滅殺藻細胞；抑藻劑的質(zhì)量濃度達到30 mg/L 時，2 d 后抑藻率可達90%以上，5 d 后接近100%，持續(xù)到16 d 抑藻率仍可達90%以上，但到了第24 d 抑制率下降到80%以內(nèi)，說明16 d 后抑藻劑沒食子酸釋放殆盡，溶液中的沒食子酸被分解消耗，無法繼續(xù)進行藻類抑制；當抑藻劑質(zhì)量濃度為60，90 和130 mg/L 時，3 d 后抑藻率可達90%以上，5 d 后可接近100%，到觀測的第24 d，抑藻率仍能維持在接近100%，說明殼聚糖載沒食子酸抑藻劑在該使用濃度下能在較長時間內(nèi)達到較高的抑藻率。這是因為殼聚糖對沒食子酸的吸附對沒食子酸起到了保護的作用而防止了其同時發(fā)生自氧化而被進一步消耗。以上結(jié)果表明：抑藻劑質(zhì)量濃度在30 mg/L以上時抑藻時間可持續(xù)15 d；當抑藻劑質(zhì)量濃度在60 mg/L 以上時抑制時間可長于24 d。

2.4 殼聚糖、沒食子酸和抑藻劑對蛋白核小球藻生長的影響

殼聚糖對蛋白核小球藻的影響如圖3(a)所示，殼聚糖對蛋白核小球藻的生長影響不顯著(p＞0.05)，未因絮凝作用而降低小球藻的總?cè)~綠素a 含量，所投加濃度梯度殼聚糖對小球藻的影響沒有表現(xiàn)出抑制的變化趨勢，說明小球藻的生長對殼聚糖的投加量沒有依賴性。沒食子酸對蛋白核小球藻的影響如圖3(b)所示，沒食子酸在低濃度的投加量下沒有表現(xiàn)出顯著的(p＞0.05)抑制作用，當沒食子酸質(zhì)量濃度為43 mg/L 時，前3 d 并未表現(xiàn)出明顯的抑制，但是隨著沒食子酸的自氧化，大量抑藻物質(zhì)生成，抑制率在隨后幾天表現(xiàn)出增加的趨勢，在9 d 達到最高值為14%，但是抑藻物質(zhì)隨后又被消耗，在13 d 和15 d 時抑制率分別下降到12%和11%。這表明在相對于可以強烈抑制水華微囊藻生長的沒食子酸濃度對蛋白核小球藻的抑制作用不明顯。抑藻劑對蛋白核小球藻的影響如圖3(c)所示。由圖3 可見：抑藻劑處理組與對照組沒有顯著性差異(p＞0.05)，當抑藻劑質(zhì)量濃度為60，90 和130 mg/L時對蛋白核小球藻的抑制率在5%以內(nèi)，而這3 個濃度卻可以顯著抑制水華微囊藻的生長，說明抑藻劑的釋放沒食子酸形成的濃度不足以抑制蛋白核小球藻的生長，對蛋白核小球藻表現(xiàn)出生態(tài)安全性。

圖3 CTS，GA 和CTS-GA 對蛋白核小球藻生長的影響Fig.3 Effects of CTS, Gallic acid and CTS-Gallic acidon growth of Chlorella pyrenoidosa

2.5 按投加比例分組比較對水華微囊藻生長的影響

按照不同梯度抑藻劑中相應(yīng)所含殼聚糖和沒食子酸的量分別作圖進行比較，如圖4 所示。圖4 中ck代表對照空白，y 代表抑藻劑，k 代表殼聚糖，m 代表沒食子酸。由圖4(a)可見：抑藻劑的釋放沒食子酸速率較慢，抑制率比直接在藻液中投加沒食子酸要低，其釋放量不足以明顯抑制藻類的生長；由圖4(b)可見：抑藻劑較直接投加沒食子酸表現(xiàn)出較好的抑制效率，但是投加初期，直接投加沒食子酸使其同時被消耗分解，所以后期抑制率降低。而抑藻劑呈現(xiàn)緩慢釋放，可以較長時間抑制藻類的生長，但是由于投加量較低，釋放量不足以明顯抑藻；由圖4(c)可見：沒食子酸加入初期表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是之后與圖4(b)所示的趨勢相同，表明此濃度下的沒食子酸不能完全抑制藻類生長。而抑藻劑表現(xiàn)出持續(xù)的抑藻效果，但是釋放速度較慢釋放量還是不足以完全抑制藻類生長；由圖4(d)可見：沒食子酸加入初期表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是到了第10 d 后，隨著沒食子酸的消耗，抑制率降低，表明沒食子酸不能持續(xù)抑制藻類生長。而抑藻劑對藻類產(chǎn)生很強的抑制效果，12 d 內(nèi)幾乎將葉綠素質(zhì)量濃度維持在200 μg/L 以內(nèi)，但是16 d 之后隨著抑藻劑釋放以及消耗，藻類又呈現(xiàn)增長趨勢；圖4(e)和(f)所示沒食子酸的抑藻效果與圖4(d)所示的相似，初期有較好的抑藻效果，分別在第5 d 和第10 d 之后抑制率變低，藻類恢復增長。而抑藻劑都表現(xiàn)出持續(xù)的抑藻效果，在24 d 內(nèi)將葉綠素a 的質(zhì)量濃度維持在25 μg/L 內(nèi)，曲線呈平緩的趨勢，抑藻劑的抑制時間可長于24 d。

3 討論

3.1 抑藻劑中殼聚糖對沒食子酸的制備以及解析

殼聚糖未經(jīng)溶解和改性便可用于沒食子酸的吸附，并且具有較高的吸附量和吸附效率，簡化了抑藻劑的制備過程，而且吸附過程在常溫等簡單條件下就可以進行。抑藻劑在室溫25 ℃下，貯存期為1.5～2 a[17]，這對抑藻劑的大量生產(chǎn)以及使用期限提供了保障。

圖4 CTS-GA 以及GA 和CTS 對水華微囊藻葉綠素a 含量的影響Fig.4 Effects of CTS-GA, GA and CTS on Chlorophyll a content of Microcystis flos-aquae

抑藻劑制備實驗結(jié)果表明：殼聚糖對沒食子酸的吸附容量很大，吸附量隨著沒食子酸濃度的升高而升高。這說明，一定量殼聚糖對沒食子酸的吸附量依賴于溶液沒食子酸的濃度，當殼聚糖吸附到?jīng)]食子酸上的速度等于沒食子酸從殼聚糖上解析下來的速度時，殼聚糖對沒食子酸的吸附達到平衡，此時過濾便可得到相應(yīng)吸附量的抑藻劑。這說明殼聚糖對沒食子酸的吸附是一個自發(fā)的過程。殼聚糖分子中存在大量孔隙可以直接吸附?jīng)]食子酸，并且這種吸附容易釋放，所以在釋放實驗中24 h 便可達到較高的濃度，足以抑制藻類的生長；殼聚糖分子中的大量羥基和氨基也可以與沒食子酸生成化學鍵，這種吸附不容易釋放[18]，所以抑藻劑可以緩慢釋放沒食子酸進行長期抑藻。沒食子酸與殼聚糖的結(jié)合部位在沒食子酸的羧酸基與殼聚糖的氨基之間形成的酰胺鍵或與羥基之間形成的酯鍵[19]。抑藻實驗結(jié)果顯示，殼聚糖對沒食子酸的吸附起到保護作用而防止其發(fā)生自氧化而同時被降解消耗，從而達到了長期抑藻的效果，解決了直接投加沒食子酸而造成的抑制時間不足的問題。

3.2 抑藻劑所釋放出的沒食子酸的抑藻機理

本實驗研究了抑藻劑對水華微囊藻和蛋白核小球藻的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)：抑藻劑對水華微囊藻具有一定的抑制效應(yīng)，且隨著濃度的增加抑制效果越明顯。抑藻劑釋放沒食子酸到培養(yǎng)基后，可能被藻細胞產(chǎn)生的抗性物質(zhì)降解，或作為碳源被藻細胞吸收代謝。隨著培養(yǎng)時間的延長，其在培養(yǎng)基中的濃度勢必會逐漸下降，當降低到一定濃度時則不能有效抑制藻細胞生長，致使抑制率下降[20-21]?；衔锝Y(jié)構(gòu)研究顯示沒食子酸的細胞毒作用不是酚類化合物所共有的，而是依賴于沒食子酸結(jié)構(gòu)上特有的特征：3 個相鄰的酚羥基是主要的活性基團[22]。因此，沒食子酸具有較強抑制作用，且效果快，通過進一步的室外實驗和生態(tài)安全評價，可望開發(fā)成長效的抑藻劑。

還有研究表明：沒食子酸的酚羥基，在過渡金屬離子如Cu2+和Fe3+存在時，自氧化可能是其化感作用的主要機制，且在一定的濃度下，氧化產(chǎn)物的抑制作用大于它本身對藻類的抑制作用[23]。進一步研究表明：在過渡金屬離子存在時，酚酸自氧化可誘導產(chǎn)生H2O2和醌，H2O2可進一步造成細胞脂質(zhì)過氧化[24]；醌則作為潛在的過氧化物，可通過氧化還原循環(huán)產(chǎn)生ROS，進而危害細胞的生長[25]。酚酸的自氧化與其苯環(huán)上羥基的位置和數(shù)量有關(guān)。本實驗采用的Bristol 和BG11 培養(yǎng)基中含有一定量的Cu2+和Fe3+，在自然水體中一般也含有Cu2+和Fe3+，因而滿足酚酸自氧化的條件。加入抑藻劑或沒食子酸之后，隨著時間的推移，低濃度溶液中的沒食子酸逐漸自氧化，產(chǎn)生的醌類氧化產(chǎn)物對水華微囊藻具有更強的抑制作用。最后，氧化產(chǎn)物被消耗，濃度不足以對藻類產(chǎn)生抑制作用，導致其抑制率降低。

3.3 抑藻劑對2 種藻生長的影響

水華微囊藻屬于藍藻為原核生物，其細胞壁主要成分肽聚糖，并且無葉綠體。蛋白核小球藻屬于綠藻為真核生物，其細胞壁堅韌主要成分為纖維素，并且有葉綠體。本文中，高濃度沒食子酸對水華微囊藻的抑制率在95%以上，而對蛋白核小球藻的抑制率卻不足10%，正是由于藍藻綠藻細胞結(jié)構(gòu)上的不同所造成的影響效果差異。Zhu 等[26]研究了沒食子酸對藍藻銅綠微囊藻和綠藻羊角月牙藻的影響，其結(jié)果表明24 h后2.65 mg/L 的沒食子酸造成銅綠微囊藻光系統(tǒng)II 和整個電子傳遞鏈活動的顯著減少，分別為70.95%和40.77%(P＜0.05)，但是對羊角月牙藻沒有抑制效果。這與本文的實驗結(jié)果一致，表明了藍藻中光系統(tǒng)Ⅱ是酚酸類化感物質(zhì)的一個攻擊位點。同時，沒食子酸能有效抑制塔瑪亞歷山大藻的生長，破壞藻細胞膜結(jié)構(gòu)，抑制藻細胞的正常分裂活動[27]。塔瑪亞歷山大藻屬于甲藻，有學者認為它是介于原核生物與真核生物之間的間核生物。這表明沒食子酸對不同細胞結(jié)構(gòu)藻類的化感作用機理需要進一步研究。

4 結(jié)論

(1) 殼聚糖對沒食子酸的吸附受到?jīng)]食子酸初始濃度、殼聚糖用量、溫度以及吸附時間等因素的影響，殼聚糖吸附?jīng)]食子酸的最優(yōu)條件為20 mL 的沒食子酸溶液中殼聚糖用量為0.02 g，溫度為25 ℃，吸附時間為60 min，沒食子酸初始質(zhì)量濃度為1 200 mg/L。

(2) 抑藻劑其解吸狀況受抑藻劑的用量和解析時間的影響，表現(xiàn)出了緩釋效果，并且殼聚糖對沒食子酸起到保護的作用而防止其降解，延長了等量的沒食子酸的使用時間。

(3) 抑藻劑對于水華微囊藻的有效用量在 30 mg/L 以上，當用量在60 mg/L 以上時抑制時間可長于24 d，屬于長效滅藻劑。在實驗濃度范圍內(nèi)，抑藻劑對于蛋白核小球藻沒有表現(xiàn)出明顯抑制效果，表現(xiàn)出對真核藻類的生態(tài)安全性。

[1] Klemas V. Remote sensing of algal blooms: An overview with case studies[J]. Journal of Coastal Research, 2012, 28(1A):34-43.

[2] LI Zhaohui, WANG Qiang, RUAN Xiao, et al. Phenolics and plant allelopathy[J]. Molecules, 2010, 15(12): 8933-8952.

[3] John J, Sarada S. Role of phenolics in allelopathic interactions[J].Allelopathy Journal, 2012, 29(2): 215-229.

[4] Mitrovic M, Jaric S, Djurdjevic L, et al. Allelopathic and Environmental implications of plant phenolic compounds[J].Allelopathy Journal, 2012, 29(2): 177-197.

[5] Kamaya Y, Tsuboi S, Takada T, et al. Growth stimulation and inhibition effects of 4-hydroxybenzoic acid and some related compounds on the freshwater green alga Pseudokirchneriella subcapitata[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2006, 51(4): 537-541.

[6] Kovacik J, Klejdus B, Hedbavny J, et al. Effect of copper and salicylic acid on phenolic metabolites and free amino acids in Scenedesmus quadricauda(Chlorophyceae)[J]. Plant Science,2010, 178(3): 307-311.

[7] Raman V, Ravi S. Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on antioxidant systems of Haematococcus pluvialis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2011, 33(3): 1043-1049.

[8] WANG Hongqiang, WU Zhengbin, ZHANG Shenghua.Relationship between the allelopathic activity and molecular structure of hydroxyl derivatives of benzoic acid and their effects on cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Allelopathy Journal, 2008, 22(1): 205-211.

[9] Pillai C K S, Paul W, Sharma C P. Chitin and chitosan polymers:Chemistry, solubility and fiber formation[J]. Progress In Polymer Science, 2009, 34(7): 641-678.

[10] 梁想, 尹平河, 趙玲, 等. 生物載體除藻劑去除海洋赤潮藻[J].中國環(huán)境科學, 2001, 121(1): 15-17.LIANG Xiang, YIN Pinghe, ZHAO Ling, et al. Removing red tide algea in the sea by biomass carrier as algaecide[J]. China Environmental Science, 2001, 121(1): 15-17.

[11] 陳玉成, 楊志敏, 李洪亮. 殼聚糖載銅滅藻劑對Chlorella pyrenoidosa 的去除[J]. 環(huán)境科學學報, 2011, 31(8): 1653-1659.CHEN Yucheng, YANG Zhimin, LI Hongliang. Removal of chlorella pyrenoidosa by copper-chitosan algaecide[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2011, 31(8): 1653-1659.

[12] Gerente C, Lee V K C, Le C P, et al. Application of chitosan for the removal of metals from wastewaters by adsorption:Mechanisms and models review[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2007, 37(1): 41-127.

[13] Ngah W S W, Teong L C, Hanafiah M A K M. Adsorption of dyes and heavy metal ions by chitosan composites: A review[J].Carbohydrate Polymers, 2011, 83(4): 1446-1456.

[14] Ludovico P, Massimiliano F. Use of chitosan and chitosanderivatives to remove arsenic from aqueous solutions[J].Carbohydrate Research, 2012, 356: 86-92.

[15] 李星, 趙亮, 楊艷玲. 錳銅復合除藻劑滅活銅綠微囊藻效能研究[J]. 北京理工大學學報, 2009, 29(10): 910-913.LI Xing, ZHAO Liang, YANG Yanling. A study on the inactivation of Microcystis Aeruginosa by manganese-copper composite algaecide[J]. Transactions of Beijing Institute of Technology, 2009, 29(10): 910-913.

[16] WANG Zhicong, LI Dunhai, QIN Hongjie, et al. An integrated method for removal of harmful cyanobacterial blooms in eutrophic lakes[J]. Environmental Pollution, 2012, 160(1):34-41.

[17] 郭滿滿, 肖卓炳, 彭密軍, 等. 沒食子酸的熱穩(wěn)定性研究[J].林產(chǎn)化學與工業(yè), 2012, 32(4): 58-62.GUO Manman, XIAO Zhuobing, PENG Mijun, et al. Thermal stability of gallic acid[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2012, 32(4): 58-62.

[18] Cigdem Y, Gokce S K, Yesim A, et al. Gallic acid-loaded chitosan nanoparticles: A preliminary study[J]. European Biotechnology Congress, 2011, 22(1): 127-133.

[19] Wanvimol P, Garry R B, Suwabun C. Chitosan gallate as a novel potential polysaccharide antioxidant: An EPR study[J].Carbohydrate Research, 2010, 345(1): 132-140.

[20] Poulson K L, Sieg R D, Prince E K, et al. Allelopathic compounds of a red tide dinoflagellate have species-specific and context-dependent impacts on phytoplankton[J]. Marine Ecology Progress Series, 2010, 416: 69-78.

[21] JIANG Dan, HUANG Lingfeng, LIN Shiquan, et al. Allelopathic effects of euhalophyte Salicornia bigelovii on marine alga Skeletonema costatum[J]. Allelopathy, 2010, 25(1): 163-172.

[22] Inoue M, Suzuki R, Sakaguchi N, et al. Selective induction of cell death in cancer cells by gallic acid[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 1995, 18(11): 1526-1530.

[23] Nakai S, Inoue Y, Hosomi M, et al. Myriophyllum spicatumreleased allelopathic polyphenols inhibiting growth of blue-green algae Microcystis aeruginosa[J]. Water Research, 2000, 34(11):3026-3032.

[24] Ayako F, Shinkji O, Mariko M, et al. (-)-Epigallocatechin gallate causes oxidative damage to isolated and cellular DNA[J].Biochemical Phamacology, 2003, 66(9): 1769-1778.

[25] Wolf B, Christa M, Kurt S. Electron paramagnetic resonance studies of radical species of proanthocyanidins and gallate esters[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2000, 374(2):347-355.

[26] ZHU Junying, LIU Biyun, WANG Jing, et al. Study on the mechanism of allelopathic influence on cyanobacteria and chlorophytes by submerged macrophyte (Myriophyllum spicatum)and its secretion[J]. Aquatic Toxicology, 2010, 98(2): 196-203.

[27] 楊維東, 張信連, 劉潔生. 酚酸類化感物質(zhì)對塔瑪亞歷山大藻生長的影響[J]. 中國環(huán)境科學, 2005, 25(4): 417-419.YANG Weidong, ZHANG Xinlian, LIU Jiesheng. The influence of allelochemicalo on the growth of Alexandrium tamarense[J].China Environmental Science, 2005, 25(4): 417-419.