蘇明瑛 彭琳琳 劉之力

點(diǎn)陣Er:YAG激光對(duì)小鼠皮膚膠原纖維及彈性纖維的影響

蘇明瑛 彭琳琳 劉之力

目的: 評(píng)價(jià)不同能量點(diǎn)陣鉺:釔鋁石榴石(Er:YAG)激光對(duì)小鼠皮膚膠原纖維及彈性纖維的影響。方法: 根據(jù)激光照射能量的不同將126只雌性昆明種小鼠分為高能量組(75 J/cm2)、低能量組(43.8 J/cm2)和對(duì)照組，觀察每組不同時(shí)間皮膚組織學(xué)變化。結(jié)果: 高能量組膠原纖維、彈力纖維數(shù)量及真皮厚度高于低能量組，但紅斑水腫期延長(zhǎng)；在接受激光照射后1個(gè)月內(nèi)，膠原纖維、彈力纖維增加速度較快。結(jié)論: 隨著照射能量的增加，點(diǎn)陣(Er:YAG)激光對(duì)真皮層膠原及彈力纖維的增生刺激相應(yīng)增強(qiáng)，但相應(yīng)的副作用也隨之增加。

點(diǎn)陣Er:YAG激光； 彈力纖維； 膠原纖維

點(diǎn)陣鉺:釔鋁石榴石(Er:YAG)激光為氣化型點(diǎn)陣激光，最近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用點(diǎn)陣(Er: YAG)激光治療毛孔粗大，皺紋及痤瘡瘢痕等，并取得了比較滿意的臨床效果，1，2但對(duì)療效的報(bào)道大部分是主觀評(píng)價(jià)，對(duì)激光照射后組織學(xué)變化的研究比較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠背部行點(diǎn)陣(Er:YAG)激光照射治療后真皮膠原纖維及彈力纖維的變化的研究進(jìn)一步明確點(diǎn)陣激光的治療機(jī)制，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組方法 隨機(jī)取126只雌性昆明種小鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)體重20±3 g，8～10周齡。分為高能量組、低能量組和對(duì)照組，每組42只，按照射后的時(shí)間1 h，1 d，3 d，7 d，14 d，28 d，56 d，再分為7小組，每小組6只。激光照射前照射區(qū)用75%乙醇常規(guī)消毒干燥后，使用點(diǎn)陣Er:YAG激光器單脈沖連續(xù)掃描打點(diǎn)照射，低能量組照射參數(shù)為43.8 J/cm2，175μm，70 spot/cm2，高能量組照射參數(shù)為75 J/cm2，300μm，70 spot/cm2，面積均為2.0 cm× 2.0 cm，只照射1遍，不重復(fù)，照射后用紅霉素眼膏涂于創(chuàng)面上，只涂搽1遍。

1.2 主要設(shè)備和試劑 Contour Profile超級(jí)平臺(tái)Er: YAG激光器(美國(guó)scion公司)；彈力纖維EVG染色液(廣州市意威醫(yī)療器械有限公司)；冰凍切片機(jī)HM52(德國(guó)美康公司)；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)HM340E (德國(guó)美康公司)；組織包埋機(jī)型號(hào)EC350(德國(guó)美康公司)；全自動(dòng)染色劑(HMS740)(德國(guó)美康公司)；光學(xué)顯微鏡(50i)(日本奧林巴斯公司)；自動(dòng)組織脫水機(jī)(Citadel)(英國(guó)三頓公司)；彩色病例圖像分析系統(tǒng)(MED6.0)(北京表克奧迪圖像技術(shù)有限公司)。

1.3 取材及實(shí)驗(yàn)方法 分別于照射后1 h，1 d，3 d，7 d，14 d，28 d，56 d，切取高能量組、低能量組和對(duì)照組皮膚樣本5 mm×5mm×3mm。所有標(biāo)本均4%甲醛浸泡固定，石蠟包埋后切片，切片厚度為4.5μm。另對(duì)照射后1 h標(biāo)本石蠟連續(xù)切片，觀察高能量組及低能量組凝固層深度與寬度的不同，其余6組常規(guī)石蠟切片，HE染色后各組切片隨機(jī)選2個(gè)視野行真皮厚度測(cè)量和膠原纖維分布的觀察；EVG染色觀察彈力纖維分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果用ˉx±s表示，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 11.5軟件，采用one－way ANOVA方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)選擇0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài) 昆明種小鼠背部皮膚經(jīng)點(diǎn)陣(Er: YAG)激光照射后，皮膚即刻出現(xiàn)一系列緊密排列的局灶性錐狀汽化剝脫微損傷，高能量組可見局灶性微損傷區(qū)輕度點(diǎn)狀出血及較多量組織液滲出，微損傷區(qū)中央凝固區(qū)范圍大于低能量組；照射后1～2 d微損傷區(qū)皮膚輕度發(fā)紅，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，自3～4 d開始炎癥和壞死組織逐漸形成痂皮并脫落，6 d內(nèi)痂皮脫落完全。

2.2 HE染色 照射后不同階段昆明鼠皮膚組織鏡下表現(xiàn)不同，激光照射后1 h，對(duì)標(biāo)本石蠟切片連續(xù)切片，測(cè)多點(diǎn)凝固層寬度及深度取平均值，高能量組凝固層寬度0.5 mm，深度0.18 mm；低能量組凝固層寬度0.4mm，深度0.1mm。照射后1 d和3 d，鏡下表皮層及真皮層均無(wú)明顯變化；照射后7 d，HE染色可見微損傷區(qū)域的真皮淺部呈現(xiàn)膠原纖維輕度增生，但比較纖細(xì)，而且排列無(wú)序；照射后14 d真皮層增厚顯著，膠原纖維增生明顯，細(xì)小的膠原開始由粗膠原代替；照射后28 d完全由粗長(zhǎng)的膠原代替，膠原排列致密，表皮也更加完整平滑，56 d時(shí)，膠原纖維仍粗大致密，且真皮層厚度仍明顯高于對(duì)照組(圖1、2)。

圖1 小鼠皮膚照射第7天皮膚組織鏡下表現(xiàn):a～c分別為低能量組、高能量組和對(duì)照組(HE，×100)

圖2 小鼠皮膚照射第28天皮膚組織鏡下表現(xiàn):a～c分別為低能量組、高能量組和對(duì)照組(HE，×100)

在照射后7 d時(shí)，真皮層厚度開始略有增加，且高能量組增加幅度大于低能量組；在照射后28 d，真皮層厚度增加更加明顯(表1)，兩組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；隨照射后時(shí)間的推移，真皮層厚度逐漸增加，高能量照射組相對(duì)于低能量照射組，在相同時(shí)間段內(nèi)，膠原纖維增生更加明顯，真皮層厚度增加也更為明顯，有顯著性差異(P＜0.05)；

2.3 彈力纖維EVG染色 低能量照射組彈力纖維增生、重組不明顯，高能量組從照射后14 d開始，可見彈力纖維含量明顯高于對(duì)照組(圖3)。

表1 照射后第3 d，7 d，14 d，28 d，56 d激光組和對(duì)照組真皮厚度的比較

圖3 照射后第28天小鼠皮膚彈力纖維染色:a，低能量組；b，高能量組(EVG，×100)

3 討論

點(diǎn)陣(Er:YAG)激光作用于小鼠皮膚后，皮膚即刻出現(xiàn)一系列緊密排列的局灶性錐狀汽化剝脫微損傷(MTZ)，照射后發(fā)現(xiàn)采用43.8 J/cm2能量照射小鼠背部皮膚時(shí)，照射區(qū)只出現(xiàn)局灶狀點(diǎn)狀凹陷，周圍伴炭化的棕色組織碎屑，當(dāng)能量增加到75 J/cm2時(shí)，微損傷區(qū)出現(xiàn)明顯點(diǎn)狀出血及組織液滲出，微損傷區(qū)中央凝固區(qū)范圍大于低能量組；激光照射后1 h，HE染色后連續(xù)切片，測(cè)多點(diǎn)凝固層寬度及深度取平均值，高能量組凝固寬度與深度都大于低能量組；1 d后高能量組照射區(qū)皮膚略紅腫，結(jié)痂明顯，低能量組皮膚表面無(wú)明顯紅腫及結(jié)痂，且低能量組照射區(qū)毛發(fā)生長(zhǎng)快于高能量照射區(qū)；6 d后高能量照射區(qū)結(jié)痂完全脫落，皮膚表面無(wú)瘢痕。由此可見在微孔密度一定條件下，當(dāng)能量增大時(shí)，治療深度、寬度、凝固厚度及熱凝固深度相應(yīng)加深，治療的深度與能量成正比，MTZ的大小與激光治療的深度成正比，既能量越大，治療深度越深，形成微損傷區(qū)的寬度越大。3HE染色及EVG染色發(fā)現(xiàn)，在相同時(shí)間段內(nèi)，高能量照射組的真皮層厚度、膠原纖維及彈力纖維含量均明顯大于低能量照射組，說(shuō)明隨著照射能量的增加，點(diǎn)陣(Er:YAG)激光對(duì)真皮層膠原及彈力纖維的刺激也相應(yīng)增大，從而治療效果也相應(yīng)增加，與Trelles等的研究相吻合，4，5然而過(guò)高能量的治療，往往也會(huì)帶來(lái)很多副作用，如紅斑水腫期的延長(zhǎng)，感染機(jī)會(huì)的增加等。在臨床工作中，對(duì)皮膚老化較重的患者，根據(jù)實(shí)際情況，可以相應(yīng)這些增加治療強(qiáng)度以獲得更好的治療效果，但也要注意伴發(fā)的不良反應(yīng)。

在照射后第3 d肉眼觀察照射部位皮膚表面結(jié)痂，高能量組及低能量組相對(duì)于對(duì)照組真皮層無(wú)明顯增厚，膠原纖維含量無(wú)明顯差別，第7 d，高能量組及低能量組相對(duì)于對(duì)照組真皮層開始增厚，膠原纖維略有增加，說(shuō)明從點(diǎn)陣(Er:YAG)激光照射后第7 d開始，嫩膚作用開始緩慢體現(xiàn)，在28 d，HE染色高能量組及低能量組相對(duì)于對(duì)照組真皮層增厚明顯，膠原排列緊密，高能量組真皮層厚度及膠原含量高于低能量組；EVG染色高能量組彈力纖維新生重組，排列緊致有序，嫩膚效果明顯，切取照射部位周圍小鼠皮膚，發(fā)現(xiàn)膠原纖維增生的面積大于原有照射面積。研究報(bào)道，點(diǎn)陣激光照射后期的真皮重塑遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出MTZ范圍。6，7激光照射1個(gè)月左右，無(wú)論從真皮層增加的厚度，還是膠原、彈力纖維排列的緊密程度都達(dá)到了頂峰，然而，此時(shí)并沒有達(dá)到治療的終點(diǎn)，在照射后56 d時(shí)，真皮層厚度及膠原、彈力纖維含量仍在繼續(xù)增加，只不過(guò)增加的速度變得緩慢，因此，點(diǎn)陣激光的遠(yuǎn)期效果較好。在低能量照射組，EVG染色后彈力纖維無(wú)明顯變化，可能與小鼠真皮層較薄彈力纖維含量較少，細(xì)微變化不能在組織切片中明顯體現(xiàn)有關(guān)。

本研究表明，點(diǎn)陣Er:YAG激光照射小鼠背部皮膚后即刻形成緊密排列的局灶性錐狀汽化剝脫微損傷，一方面局灶性微損傷可加速皮膚早期愈合，另一方面這種點(diǎn)陣狀熱刺激會(huì)均勻的啟動(dòng)皮膚的自我修復(fù)程序，最終導(dǎo)致包括表皮和真皮在內(nèi)的全層皮膚發(fā)生重塑和重建，從而改善皮膚的衰老狀態(tài)。在微孔密度一致情況下，隨激光照射能量的增加，對(duì)真皮層的刺激將不斷增加，進(jìn)而達(dá)到更明顯的嫩膚效果。在臨床治療中，我們發(fā)現(xiàn)，在接受點(diǎn)陣(Er:YAG)激光照射后1～3 d，被照射者皮膚出現(xiàn)潮紅、腫脹、輕微滲出，這是(MTZ)在進(jìn)行自我修復(fù)，此時(shí)應(yīng)給予心理疏導(dǎo)，緩解被照射者緊張情緒，配合外敷醫(yī)用修復(fù)面膜促進(jìn)水腫消退，口服維生素C預(yù)防色沉形成；6 d內(nèi)修復(fù)完成，表皮結(jié)痂大部分脫落；3～7 d，被照射者皮膚輕微干燥，皮膚略顯腫脹，此時(shí)真皮層增厚明顯，不排除真皮組織水腫，此時(shí)膠原纖維及彈力纖維開始出現(xiàn)，呈不規(guī)則排列，形狀纖細(xì)。7 d開始內(nèi)部重組顯著出現(xiàn)，至28 d時(shí)真皮層增厚明顯，膠原、彈力纖維重新致密排列，被照射者皮膚光澤度、彈性增加，至56 d真皮層仍增厚，膠原、彈力纖維仍在緩慢增生，臨床上觀察到被照射者皮膚彈性仍增加，皺紋減輕，滿意度增加，這與實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果相符，為臨床提供了理論指導(dǎo)。我們將繼續(xù)隨訪觀察患者恢復(fù)情況，以明確其遠(yuǎn)期療效。

1 Lapidoth M，Yagima Odo ME，Odo LM.Novel use of erbium: YAG(2，940 nm)laser for fractional ablative photothermolysis in the treatment of photodamaged facial skin:apilot study.Dermatol Surg，2008，34(8):1048－1053.

2吳嚴(yán)，李遠(yuǎn)宏.點(diǎn)陣式Er:YAG激光治療痤瘡瘢痕及毛孔粗大的療效觀察.中華皮膚科雜志，2010，43(2):105－107.

3 Bedi VP，Chan KF，Sink RK，et al.The effects of pulse energy variations on the diamensions of microscopic thermai treatment zones in nonablative fractional resurfacing.Lasers Surg Med，2007，39(2):145－155.

4 Trelles MA，Mordon S，Velez M，et al.Results of fractional ablative facial skin resurfacing with the erbium:yttium－aluminium－garnet laser 1 week and 2 months after one single treatment in 30 patients.LasersMed Sci，2009，24(2):186－194.

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6 Hantash BM，Bedi VP，Kapadia B，et al.Invito histological evaluation of a novel ablative fractional resurfacing device.Lasers Surg Med，2007，39(2):96－107.

7Hantash BM，Bedi VP，Chan KF，et al.Ex vivo histological characterization of a novel ablative fractional resurfacing device. Lasers Surg Med，2007，39(2):87－95.

(收稿:2013－12－17 修回:2014－03－14)

Effects of Er:YAG laser irradiation on the elastic fibers and collagenic fibers in m ice

SU Ming-ying，PENG Lin-lin，LIU Zhi-li.Dalian Dermatosis Hospital，Dalian，116021

Objective:To determine the effects of Er:YAG laserwith different energies on the changes of elastic fibers and collagenic fibers inmice.Methods:One hundred and twenty-six mice were divided into the high－energy group(75 J/cm2)，low－energy group(43.8 J/cm2)and control group.Hematoxylin and eosin staining and EVG staining were performed to determine the changes of skin after laser irradiation.Results: The elastic fibers，collagenic fibers and the thickness of the dermis in high－energy group were higher than those in other groups，but the time of the erythema edema period was longer.The elastic fibers and collagenic fibers increased quicklywithin amonth after laser irradiation.Conclusion:The elastic fibers and collagenic fibers increased alongwith the increase of laser energy，but the side effect increased accordingly.

Er:YAG laser；elasticity fibers；collagen fibers

大連市皮膚病醫(yī)院，116021