鐘近藝+鄭禾+崔燕

[摘 要] 采用整形脈沖和選擇性激發(fā)技術(shù)，設(shè)計(jì)了一維磷選擇性氫磷異核單量子相干（1H-31PHSQC）及多量子相干（1H-31PHMQC）脈沖序列，并以此為基礎(chǔ)建立了相應(yīng)檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明，選擇性一維1H-31PHMQC技術(shù)比1H-31PHSQC靈敏度更高，可用于逐一分析和指認(rèn)環(huán)境基質(zhì)中的含磷化學(xué)毒劑。

[關(guān)鍵詞] 氫磷相關(guān)；核磁共振；化學(xué)位移；耦合常數(shù)；化學(xué)毒劑

中圖分類(lèi)號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2055-5200（2014）01-009-04

Doi：10.11876/mimt201401003

The Application of Phosphorus-Selective 1H-31P Heteronuclear Coherence Technique on Detection of Organophosphorous Chemical Warfare Agents ZHONG Jin-yi1，2， ZHENG He2， CUI Yan2. （1.State Key Laboratory of NBC Protection For Civilian， Beijing 102205；2.Research Institute of Chemical Defence， Beijing 102205）

[Abstract] Introducing shaping pulses and selective excitation techniques， the Phosphorus-selective one-dimensional 1H-31P HSQC and HMQC were applied respectively to experiments. Compared to 1H-31P HSQC， application of the 1H-31P HMQC method resulted in more sensitive， and it is an effective technique for screening and identification of organophosphorus chemical warfare agents in environmental samples.

[Key words] 1H-31P heteronuclear multiple quantum coherence； NMR； Chemical shift； Coupling constant； Chemical warfare agent

引 言

在諸多的核磁共振技術(shù)中，選擇性激發(fā)技術(shù)主要用于溶劑峰壓制和核磁共振譜峰的精細(xì)結(jié)構(gòu)研究[1]，但隨著分析需求的不斷提高，選擇性激發(fā)技術(shù)在混合物分析中嶄露頭角[2-3]，特別是在結(jié)構(gòu)相近化合物的分析中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用[4-5]，在化學(xué)毒劑的分析中也是如此[6]，神經(jīng)性含磷化學(xué)毒劑由于其速殺性，一直是《禁止化學(xué)武器公約》監(jiān)控的重點(diǎn)，但該類(lèi)化合物在環(huán)境中易降解，因此降解產(chǎn)物也是核查的關(guān)鍵證據(jù)，但降解產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)相近，氫譜譜峰之間重疊嚴(yán)重，僅用磷譜也難以區(qū)分。從結(jié)構(gòu)上看，大多數(shù)神經(jīng)性含磷化學(xué)毒劑的通式為：

其中，R1不僅是構(gòu)成化學(xué)毒劑的關(guān)鍵元素，而且R1都具有共同的結(jié)構(gòu)特征，即R1上與磷直接相連的氫核（或烷基氫/烷胺基氫）均與磷核發(fā)生耦合，雖然相隔兩個(gè)化學(xué)鍵，耦合常數(shù)仍介于10～22Hz之間。環(huán)境基質(zhì)的含磷背景干擾非常少，磷譜較為干凈，即使存在含磷化合物的干擾，由于磷譜的化學(xué)位移范圍較寬、譜線(xiàn)分辨率較好，一般不會(huì)出現(xiàn)譜峰之間的重疊，我們以此為選擇性激發(fā)實(shí)驗(yàn)的突破口，通過(guò)磷磁化矢量的選擇，建立磷選擇性氫磷相關(guān)方法，以獲取含磷化合物上磷氫核之間的連接關(guān)系，設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)了磷選擇性一維反式氫磷相關(guān)脈沖序列，并首次成功將該技術(shù)用于水樣中含磷化學(xué)毒劑降解產(chǎn)物的混合物分析中，解決了多種含磷化合物的逐一指認(rèn)問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

W0樣品為含有4種有機(jī)烷基膦酸的水樣，依次為甲基膦酸（MPA），乙基膦酸（EPA），丙基膦酸（PPA），異丙基膦酸（iPPA），這4種含磷化合物均為神經(jīng)性毒劑的降解產(chǎn)物。濃度分別為380μg/ mL、362μg/mL、226μg/mL和312μg/mL。結(jié)構(gòu)如圖1所示。取0.5mLW0樣品，用0.15mL重水（D2O）鎖場(chǎng)。

圖1 四種烷基膦酸結(jié)構(gòu)

1.2 儀器與試劑

譜儀：Varian NMR System 600M核磁共振波譜儀，AutoXBB探頭，1H共振頻率為599.778MHz，31P的共振頻率為240.0MHz，測(cè)試溫度為298K，1H和31P的化學(xué)位移分別以DSS和H3PO4（85%）為外標(biāo)。

試劑：實(shí)驗(yàn)中所用的氘代試劑均為美國(guó)CIL公司產(chǎn)品，氘代率不小于99.8%。1.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1H譜：脈沖序列為s2pul，45°激發(fā)脈沖角采集，譜寬6kHz，采樣時(shí)間2.0s，弛豫延遲時(shí)間1s，譜圖用指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行加權(quán)（lb=1.0Hz）。

31P{1H}NMR譜：脈沖序列為s2pul，45°激發(fā)脈沖角采集，譜寬30kHz，弛豫延遲1s，采樣時(shí)間2.0s，采用WALTZ組合脈沖進(jìn)行質(zhì)子去耦，譜圖用指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行加權(quán)（lb=1.0Hz）。

磷選擇性一維1H-31PHSQC和1H-31PHMQC譜：均使用整形31P脈沖，偏置和帶寬與所需選擇性激發(fā)的磷峰相匹配，選擇高斯整形脈沖。耦合常數(shù)JHP為 24Hz，延遲為梯度脈沖時(shí)間（1ms）和梯度恢復(fù)延遲時(shí)間（100μs）的總和，HSQC用于相干選擇的梯度強(qiáng)度（g1，g2）為44.8和17.9g/cm，HMQC用于相干選擇的梯度強(qiáng)度（g1，g2，g3）分別為28、12、0g/ cm，采樣時(shí)間和弛豫延遲為1.0和2.0s，譜圖在傅立葉變化前進(jìn)行加權(quán)（lb=1.0）。

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性脈沖的實(shí)現(xiàn)

選擇性激發(fā)主要是通過(guò)整形脈沖來(lái)實(shí)現(xiàn)。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時(shí)域信號(hào)不同，經(jīng)傅立葉變換后產(chǎn)生不同的頻域圖，即激發(fā)的頻譜寬度不同，當(dāng)選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發(fā)頻譜的寬度，通過(guò)調(diào)整偏置來(lái)對(duì)準(zhǔn)所選磷譜位置，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)磷譜的選擇性激發(fā)。

2.2 脈沖序列的實(shí)現(xiàn)

在脈沖序列的實(shí)現(xiàn)上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區(qū)域的硬脈沖，固定延遲取代演化時(shí)間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對(duì)于給定的場(chǎng)強(qiáng)來(lái)說(shuō)，選擇性180°脈沖的選擇性較相應(yīng)的90°脈沖好，但可用于選擇性激發(fā)的范圍大大減少，我們通過(guò)對(duì)HSQC中的180°脈沖進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，對(duì)HMQC中的90°脈沖進(jìn)行選擇性激發(fā)，設(shè)計(jì)了兩種選擇性激發(fā)脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設(shè)梯度，以便選取180°質(zhì)子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質(zhì)子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質(zhì)子信號(hào)被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個(gè)延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關(guān)脈沖序列測(cè)定W0的結(jié)果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關(guān)化合物的1H化學(xué)位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學(xué)位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數(shù)上（17.4Hz）可以進(jìn)一步確認(rèn)其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無(wú)法從積分面積獲取質(zhì)子間比例的信息，化學(xué)位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認(rèn)為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無(wú)背景干擾，我們可以采用同核相關(guān)技術(shù)（gCOSY）進(jìn)行質(zhì)子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關(guān)確認(rèn)異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關(guān)、1.44ppm和1.58ppm的相關(guān)可以將這些質(zhì)子明確指認(rèn)為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的烷基膦酸的磷譜見(jiàn)圖6，四種有機(jī)磷化合物的化學(xué)位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學(xué)位移無(wú)法確定四個(gè)磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開(kāi)，直接可以完成化合物的指認(rèn)，多重峰的譜線(xiàn)強(qiáng)度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強(qiáng)度信息。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性脈沖的實(shí)現(xiàn)

選擇性激發(fā)主要是通過(guò)整形脈沖來(lái)實(shí)現(xiàn)。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時(shí)域信號(hào)不同，經(jīng)傅立葉變換后產(chǎn)生不同的頻域圖，即激發(fā)的頻譜寬度不同，當(dāng)選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發(fā)頻譜的寬度，通過(guò)調(diào)整偏置來(lái)對(duì)準(zhǔn)所選磷譜位置，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)磷譜的選擇性激發(fā)。

2.2 脈沖序列的實(shí)現(xiàn)

在脈沖序列的實(shí)現(xiàn)上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區(qū)域的硬脈沖，固定延遲取代演化時(shí)間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對(duì)于給定的場(chǎng)強(qiáng)來(lái)說(shuō)，選擇性180°脈沖的選擇性較相應(yīng)的90°脈沖好，但可用于選擇性激發(fā)的范圍大大減少，我們通過(guò)對(duì)HSQC中的180°脈沖進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，對(duì)HMQC中的90°脈沖進(jìn)行選擇性激發(fā)，設(shè)計(jì)了兩種選擇性激發(fā)脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設(shè)梯度，以便選取180°質(zhì)子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質(zhì)子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質(zhì)子信號(hào)被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個(gè)延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關(guān)脈沖序列測(cè)定W0的結(jié)果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關(guān)化合物的1H化學(xué)位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學(xué)位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數(shù)上（17.4Hz）可以進(jìn)一步確認(rèn)其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無(wú)法從積分面積獲取質(zhì)子間比例的信息，化學(xué)位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認(rèn)為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無(wú)背景干擾，我們可以采用同核相關(guān)技術(shù)（gCOSY）進(jìn)行質(zhì)子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關(guān)確認(rèn)異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關(guān)、1.44ppm和1.58ppm的相關(guān)可以將這些質(zhì)子明確指認(rèn)為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的烷基膦酸的磷譜見(jiàn)圖6，四種有機(jī)磷化合物的化學(xué)位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學(xué)位移無(wú)法確定四個(gè)磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開(kāi)，直接可以完成化合物的指認(rèn)，多重峰的譜線(xiàn)強(qiáng)度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強(qiáng)度信息。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇性脈沖的實(shí)現(xiàn)

選擇性激發(fā)主要是通過(guò)整形脈沖來(lái)實(shí)現(xiàn)。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時(shí)域信號(hào)不同，經(jīng)傅立葉變換后產(chǎn)生不同的頻域圖，即激發(fā)的頻譜寬度不同，當(dāng)選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發(fā)頻譜的寬度，通過(guò)調(diào)整偏置來(lái)對(duì)準(zhǔn)所選磷譜位置，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)磷譜的選擇性激發(fā)。

2.2 脈沖序列的實(shí)現(xiàn)

在脈沖序列的實(shí)現(xiàn)上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區(qū)域的硬脈沖，固定延遲取代演化時(shí)間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對(duì)于給定的場(chǎng)強(qiáng)來(lái)說(shuō)，選擇性180°脈沖的選擇性較相應(yīng)的90°脈沖好，但可用于選擇性激發(fā)的范圍大大減少，我們通過(guò)對(duì)HSQC中的180°脈沖進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，對(duì)HMQC中的90°脈沖進(jìn)行選擇性激發(fā)，設(shè)計(jì)了兩種選擇性激發(fā)脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設(shè)梯度，以便選取180°質(zhì)子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質(zhì)子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質(zhì)子信號(hào)被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個(gè)延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關(guān)脈沖序列測(cè)定W0的結(jié)果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關(guān)化合物的1H化學(xué)位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學(xué)位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數(shù)上（17.4Hz）可以進(jìn)一步確認(rèn)其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無(wú)法從積分面積獲取質(zhì)子間比例的信息，化學(xué)位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認(rèn)為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無(wú)背景干擾，我們可以采用同核相關(guān)技術(shù)（gCOSY）進(jìn)行質(zhì)子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關(guān)確認(rèn)異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關(guān)、1.44ppm和1.58ppm的相關(guān)可以將這些質(zhì)子明確指認(rèn)為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的烷基膦酸的磷譜見(jiàn)圖6，四種有機(jī)磷化合物的化學(xué)位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學(xué)位移無(wú)法確定四個(gè)磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開(kāi)，直接可以完成化合物的指認(rèn)，多重峰的譜線(xiàn)強(qiáng)度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強(qiáng)度信息。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.