尹靈梅，陳 黎綜述，張 鈾△審校

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，昆明650101；2.武警云南總醫(yī)院門(mén)診部，昆明650203）

具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在機(jī)體對(duì)內(nèi)源性及外源性抗原的免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在機(jī)體由于免疫系統(tǒng)功能紊亂所致的疾病中發(fā)揮有重要作用。機(jī)體有很多種類(lèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞型，主要包括自然發(fā)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。其中1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（type 1regulatory T cell，Tr1）是由初始CD4＋T細(xì)胞分化而來(lái)的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其特點(diǎn)是能夠生成大量具有免疫抑制功能的IL－10，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）－β。Tr1細(xì)胞對(duì)維持外周免疫耐受，抑制自身免疫反應(yīng)和異常免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷有重要作用。同時(shí)還能抑制移植排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）。鑒于Tr1細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，經(jīng)體外擴(kuò)增得到的人類(lèi)Tr1細(xì)胞對(duì)人類(lèi)疾病治療現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。本文主要對(duì)Tr1細(xì)胞的生物學(xué)特征，以及在GVHD的臨床應(yīng)用潛能作一綜述。

1 Tr1細(xì)胞概述

機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能包括免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視。免疫功能紊亂將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)／免疫缺陷病，自身免疫病，腫瘤，慢性感染。免疫系統(tǒng)功能的有效發(fā)揮有賴(lài)于機(jī)體的免疫調(diào)控系統(tǒng)，特別是負(fù)調(diào)控作用，其中具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答有重要作用?，F(xiàn)在經(jīng)研究闡明的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞型主要包括CD4＋CD25＋Foxp3＋T細(xì)胞［1］以及分泌IL－10的 Tr1［2］，CD4＋Th3，CD4－CD8－T細(xì)胞［2］。Tr1細(xì)胞是一類(lèi)誘導(dǎo)型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在體內(nèi)或體外某些條件下可以誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞向Tr1細(xì)胞分化［3－4］。這類(lèi)細(xì)胞的特點(diǎn)是能分泌大量具有免疫抑制效應(yīng)的IL－10、TGF－β，無(wú)IL－4的分泌［3］（IL－4是IgE生成的正調(diào)節(jié)因子，IgE是參與Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要抗體），無(wú)Foxp3基因的表達(dá)［5］。它對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答以及誘導(dǎo)外周免疫耐受具有重要作用。Tr1細(xì)胞最早是在接受了同種異體造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）并產(chǎn)生長(zhǎng)期移植耐受的重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficient，SCID）患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的?，F(xiàn)在也有研究發(fā)現(xiàn)，在接受人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相合的 HSCT的β－地中海貧血的患者體內(nèi)也有Tr1細(xì)胞的存在，并且與患者移植后誘導(dǎo)移植嵌合形成有關(guān)［6］。

2 Tr1細(xì)胞特征及其生物學(xué)效應(yīng)

人類(lèi)Tr1細(xì)胞最早是在成功接受HLA不相合HSCT并且產(chǎn)生了長(zhǎng)期免疫耐受的SCID患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，將這些患者外周血同種異體反應(yīng)性CD4＋T細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些CD4＋T細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IL－10，而無(wú)IL－4和IL－2的生成，這類(lèi)CD4＋T細(xì)胞及其效應(yīng)分子還與受者在不需接受免疫抑制治療也可建立移植耐受且不發(fā)生GVHD相關(guān)［7］。將人或鼠CD4＋T細(xì)胞在體外條件下與大劑量IL－10共培養(yǎng)，該培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化得到的T細(xì)胞亞類(lèi)其效應(yīng)分子的生成與Th1和Th2細(xì)胞不同，但與成功接受HLA不相合HSCT并且產(chǎn)生了長(zhǎng)期免疫耐受的SCID患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞分泌的效應(yīng)分子相同。這類(lèi)T細(xì)胞克隆能夠分泌大量的IL－10、TGF－β，少量的γ干擾素、IL－2，無(wú)IL－4的生成，而且這類(lèi)細(xì)胞能夠通過(guò)分泌IL－10、TGF－β抑制同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的活化。

Tr1細(xì)胞功能的發(fā)揮有賴(lài)于特異性的抗原作用于細(xì)胞表面受體后活化增殖分化，Tr1細(xì)胞一旦活化后其免疫調(diào)節(jié)作用是無(wú)特異性的［3－4］?；罨蟮腡r1細(xì)胞其增殖能力有限，可表達(dá)活化相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志如：CD25、CD40L、CD69、HLA－DR以及CD152［8］。Tr1細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能主要與其生成具有免疫抑制功能的效應(yīng)分子IL－10、TGF－β相關(guān)［4，9］。IL－10是一種具有強(qiáng)大免疫抑制功能的細(xì)胞因子，它被認(rèn)為是控制炎性反應(yīng)，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能以及維持免疫耐受的重要調(diào)節(jié)因子。IL－10主要作用于抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）［9］，通過(guò)抑制主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（major histocompatability complex－Ⅱ，MHC－Ⅱ），共刺激分子以及促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)抑制APC的功能。IL－10也可以直接抑制T細(xì)胞的功能及效應(yīng)分子的產(chǎn)生。Tr1細(xì)胞除了通過(guò)生成具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)揮其免疫調(diào)控作用外還可通過(guò)與靶細(xì)胞的直接接觸發(fā)揮效應(yīng)，Tr1細(xì)胞通過(guò)生成穿孔素B和顆粒酶對(duì)效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮直接殺傷作用。在體外經(jīng)CD3，CD46單克隆抗體誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞分化生成的產(chǎn)生IL－10的T細(xì)胞亞類(lèi)能夠生成穿孔素B［10］。Tr1細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶裂解APC需要Tr1細(xì)胞識(shí)別APC表面的HLA－Ⅰ類(lèi)分子，細(xì)胞表面黏附分子LFA－Ⅰ介導(dǎo)的Tr1細(xì)胞與APC的免疫黏附，以及Tr1細(xì)胞表面CD2、CD266的活化［10］。

很多研究期望能夠發(fā)現(xiàn)Tr1細(xì)胞的特異性標(biāo)記，從而將Tr1細(xì)胞與其他類(lèi)型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相區(qū)分。Cobbold等［11］比較了鼠和人的Tr1和CD4＋CD25＋Foxp3＋T細(xì)胞的基因組成發(fā)現(xiàn)GATA3（ROG）在Tr1細(xì)胞中表達(dá)而未在CD4＋CD25＋Foxp3＋T細(xì)胞中表達(dá)，但是ROG在其他類(lèi)型的活化的輔助性T細(xì)胞中也有表達(dá)。

3 Tr1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

Tr1是一種誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，現(xiàn)在有很多研究對(duì)能夠誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞分化的因素進(jìn)行了研究。在體內(nèi)或者體外某些條件刺激下都可誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞向Tr1細(xì)胞的分化。

IL－10被認(rèn)為是誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞分化最主要的因素，因此IL－10不僅是Tr1細(xì)胞的效應(yīng)分子而且也是其誘導(dǎo)分化的重要調(diào)節(jié)因子。在體外大劑量的IL－10可以誘導(dǎo)鼠或人的初始CD4＋T細(xì)胞向 Tr1細(xì)胞分化［3，9］。IL－12家族的成員IL－27是最近研究發(fā)現(xiàn)的也能夠誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞分化的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子［12－14］。在人體CD46、CD3單克隆抗體能夠誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞向Tr1細(xì)胞分化［15］。初始CD4＋T細(xì)胞與耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞（tolerogenic dendritic cell，DC－tol）共培養(yǎng)可誘導(dǎo)其向 Tr1細(xì)胞分化［16］，DC在IL－10或半乳糖結(jié)合凝集素galectin－1的誘導(dǎo)下可分化發(fā)育為DC－tol，DC－tol與初始CD4＋T細(xì)胞共培養(yǎng)后也可誘導(dǎo)CD4＋T細(xì)胞向Tr1分化［12］。而且該作用與DC細(xì)胞分泌IL－27作用于CD4＋T細(xì)胞表面的IL－27受體后通過(guò)STAT信號(hào)通路發(fā)揮功能有關(guān)［12－13］。除了在體外條件下對(duì)Tr1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在體內(nèi)條件下也可誘導(dǎo)分化出Tr1細(xì)胞。對(duì)接受了胰島移植的鼠模型體內(nèi)給予給予西羅莫司聯(lián)合CD45RB單克隆抗體和IL－10也能誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞的分化，促進(jìn)其免疫耐受的建立［17］。現(xiàn)在應(yīng)用這些方法進(jìn)行體外擴(kuò)增所得到的Tr1細(xì)胞有很大一部分是沒(méi)有功能的，從而抑制了Tr1細(xì)胞的臨床應(yīng)用潛能。為了克服體外擴(kuò)增的障礙，現(xiàn)在也有研究通過(guò)基因工程的方法得到轉(zhuǎn)導(dǎo)有人類(lèi)IL－10基因的CD4＋T細(xì)胞（CD4LV－IL－10）［18］，這類(lèi)細(xì)胞具有 Tr1細(xì)胞的功能特點(diǎn)，能夠生成大量的IL－10、TGF－β，抑制同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的活性。在異種移植的GVHD動(dòng)物模型中，這類(lèi)細(xì)胞能夠抑制GVHD的發(fā)生。

4 Tr1細(xì)胞與GVHD

Tr1細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，現(xiàn)在已有研究表明Tr1細(xì)胞能夠抑制GVHD的發(fā)生。異基因HSCT是目前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的最佳治療手段，而GVHD是異基因HSCT最嚴(yán)重的并發(fā)癥，大部分接受異基因HSCT的患者都會(huì)經(jīng)歷不同程度的GVHD，因而GVHD是目前困擾異基因HSCT移植成功的主要障礙［19］。盡管在移植后使用免疫抑制劑預(yù)防GVHD，甚至供體是HLA相合的供者，GVHD仍可發(fā)生。GVHD的發(fā)生主要是由于供受者間抗原不合，供者T淋巴細(xì)胞識(shí)別受者同種異型抗原后活化增殖分化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，對(duì)受者組織器官發(fā)動(dòng)免疫攻擊。臨床GVHD主要分為急性和慢性GVHD?，F(xiàn)在臨床對(duì)GVHD的預(yù)防及治療主要是免疫抑制劑的使用以及去除移植物中的T淋巴細(xì)胞，現(xiàn)在也有報(bào)道使用CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞預(yù)防GVHD［20－22］。

研究發(fā)現(xiàn)，接受造血干細(xì)胞移植的受者在接受移植之前如果體內(nèi)外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monocyte cell，PBMC）能夠自發(fā)生成大量IL－10，那么在其接受骨髓移植后發(fā)生急性GVHD以及移植的相關(guān)病死率就比較低［23］。而供體細(xì)胞在受者同種異體抗原刺激后分化為生成IL－10的細(xì)胞的數(shù)量越多，那么受者發(fā)生急性GVHD的機(jī)會(huì)越小，反之亦然［24］。同時(shí)對(duì)人IL－10啟動(dòng)子核苷酸多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)IL－10的高轉(zhuǎn)錄水平對(duì)造血干細(xì)胞移植后受者急性GVHD的發(fā)生是一個(gè)保護(hù)因素［25］。IL－10是Tr1細(xì)胞發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能的主要效應(yīng)分子，因此可以將Tr1細(xì)胞作為臨床預(yù)防GVHD的治療手段。

HLA半相合HSCT為臨床需要進(jìn)行干細(xì)胞移植而未找到相合供者的患者帶來(lái)了希望。但GVHD的高發(fā)生率仍使患者的病死率未改善。為了減輕移植后GVHD的發(fā)生，現(xiàn)臨床除了使用免疫抑制劑外還采用了去除成熟T淋巴細(xì)胞的大劑量CD34＋造血干細(xì)胞移植，去除移植物中的T淋巴細(xì)胞對(duì)改善移植后GVHD的發(fā)生有很大作用，但移植后由于缺乏有效的移植物抗白血?。╣raft versus leukemia，GVL）效應(yīng)而導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)率增加以及增加了患者致命感染的發(fā)生。為了提高臨床HLA半相合HSCT的成功率，研究者將體外誘導(dǎo)得到的同種異體抗原特異性Tr1細(xì)胞作為HSCT的輔助治療手段［28］。該方法是在體外將供者T淋巴細(xì)胞與受者PBMC與IL－10共培養(yǎng)，然后將誘導(dǎo)分化得到的T淋巴細(xì)胞輸注到接受HLA半相合HSCT患者體內(nèi)。應(yīng)用該方法誘導(dǎo)分化得到的T細(xì)胞中除了有大量同種異體抗原特異性Tr1細(xì)胞，還包含了初始以及記憶性T細(xì)胞，所以與單純接受移植治療的患者比較急性GVHD的程度較輕，而且未發(fā)生慢性GVHD。

基于這些研究基礎(chǔ)，筆者的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將研究經(jīng)galectin－1處理的小鼠DC誘導(dǎo)初始CD4＋T細(xì)胞向Tr1細(xì)胞分化的可能機(jī)制，并嘗試應(yīng)用galectin－1誘導(dǎo)分化得到的小鼠DC來(lái)預(yù)防小鼠急性以及慢性GVHD的發(fā)生。如果該實(shí)驗(yàn)成功，就可在不降低免疫功能及不影響GVL效應(yīng)的情況下為解決異基因HSCT成功的障礙提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床GVHD的預(yù)防和治療提供新的方向。

綜上所述，Tr1細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控作用對(duì)減輕HSCT后GVHD的發(fā)生有重要意義，而且Tr1細(xì)胞是一種誘導(dǎo)型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，我們可以通過(guò)體外誘導(dǎo)得到一定數(shù)量的Tr1細(xì)胞用于臨床。但體內(nèi)Tr1細(xì)胞的存在會(huì)導(dǎo)致慢性感染以及抗腫瘤免疫不能有效發(fā)揮。現(xiàn)在對(duì)Tr1細(xì)胞治療人類(lèi)疾病的臨床試驗(yàn)還較少，對(duì)其治療可能的相關(guān)不良反應(yīng)還不是很清楚，因此還需要對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究。

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