張偉偉，袁蓓，張占路，趙楊敏，徐秉良，吳燕民＊

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081；3.深圳市農(nóng)科集團有限公司，廣東 深圳518040）

自2003年到2013年，高致病性禽流感H5N1共引起人患病630例，致死375人，大規(guī)模捕殺家禽及候鳥數(shù)量更是數(shù)以億計，給世界各地造成嚴重的經(jīng)濟損失和巨大的生命安全威脅。早在1992年，Mason等［1］提出了“植物可食疫苗”的概念，成功利用煙草（Nicotianatabacum）表達了乙肝表面抗原（HBsAg）基因。近十年已有大量的抗原被植物表達，包括抵御 HIV的2G12抗體［2］、乙肝表面抗原［3－5］、霍亂毒素B亞基［6］、大腸桿菌熱敏毒素B亞基［7－8］、狂犬病毒G蛋白［9］等，但是目前禽流感植物疫苗的報道還是較少且抗原蛋白表達量低限制了植物疫苗進一步的發(fā)展［10］。

大量研究表明，影響重組藥用蛋白在植物中表達量的因素包括很多方面。一是轉(zhuǎn)錄水平，啟動子的選擇是提高外源基因表達水平的關鍵。常用的啟動子分為組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子和人工合成啟動子。前3種啟動子都可以實現(xiàn)外源基因的表達與調(diào)控，但人工合成啟動子能夠進一步提高外源基因的表達水平。如重復CaMV35啟動子的增強子序列，構(gòu)建雙35S啟動子，可顯著提高外源基因的表達水平［11－12］。終止子通過終止轉(zhuǎn)錄和對mRNA 3′端的加工調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平，進而影響外源基因在植物中的表達水平。Nagaya等［13］分別比較了不同終止子，發(fā)現(xiàn)熱擊蛋白18.2終止子能有效提高外源基因表達水平。二是翻譯水平，研究表明通過增強mRNA的穩(wěn)定性［14－15］，按照植物偏愛密碼子進行密碼子優(yōu)化可有效提高重組蛋白的表達水平［16］。三是翻譯后水平，重組蛋白合成后，利用不同定位信號可以定位于不同的亞細胞結(jié)構(gòu)中，亞細胞結(jié)構(gòu)的生理生化環(huán)境、存儲空間等多種因素都影響著蛋白的積累水平。為外源蛋白選擇合適的分揀部位，有助于其高濃度富集。例如在重組蛋白C－添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列－KDEL，可以增加外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累水平［17］。鄭琳琳等［18］證明可通過構(gòu)建超表達載體有效提高外源基因的表達水平。

本研究選擇豆科全價飼料牧草百脈根（Lotuscorniculatus）［19］作為受體植物，在已建立的，以磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（PMI）為篩選標記的，安全高效的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎上，利用已獲得的禽流感血凝素（HA）和大腸桿菌不耐熱毒素B亞基（LTB）融合基因，通過添加強啟動子，增強子Ω序列、KDEL序列及加長poly（A）序列等多種調(diào)控元件，構(gòu)建HA－LTB高效融合植物表達載體，以期提高HA抗原蛋白表達量，建立外源融合抗原蛋白高水平表達平臺，為禽流感可飼疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 百脈根：栽培品種里奧（L.corniculatuscv.Leo）由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所作物與分子實驗室提供。

1.1.2 菌種及載體 大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實驗室保存，pCAMBIA2301、pMD19－T商業(yè)載體購于 Takara生物公司，pMD－2E＋35S、pMD－Ω由本實驗室保存，pMD－Nos－poly（A）由本實驗室設計經(jīng)金為智生物公司合成，pCAMBIA2301－PMI－HA－LTB－MARs植物融合表達載體由本實驗室保存。

1.1.3 工具酶和主要生物學試劑EcoRⅠ、HindⅢ、MluⅠ等限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Ex Taq Polymerase、LA Taq Polymerase購自Takara生物公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech）；高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、通用植物總RNA提取試劑盒購自百泰克生物公司（Bioteke）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司；Gel/PCR Extraction kit購自Biomiga生物公司；大腸桿菌熱敏毒素B亞基酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自R＆D system。

1.1.4 培養(yǎng)基 B5培養(yǎng)基（phytotech B5media）、MS培養(yǎng)基（Murashige Skoog medium）購自美國 Phyto Technology生物技術公司，YEB培養(yǎng)基（agrobacterium rhizogene medium）、LB培養(yǎng)基（Luria－Bertani bacterial medium）、植物凝膠（phytagel）、甘露糖購自北京拜爾迪生物公司（Biodee），1mg/mL的BSA標準品（Bovine Serum Albumin Standard Ampules）購自GeneStar公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.5 引物與測序 利用Primer 5.0引物設計軟件，根據(jù)相關基因序列及需要添加酶切位點序列、基因片段序列設計、載體構(gòu)建過程中所有測序工作，由北京奧科生物技術有限公司完成，引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target genes

1.2 試驗方法

1.2.1 高效植物表達載體的設計和構(gòu)建 在已有載體pCAMBIA2301－PMI－MARs和HA－LTB融合基因的基礎上，首先通過引物設計在LTB后添加KDEL序列，并利用HA－BamHⅠ引物和LTB－KDEL－SalⅠ/PstⅠ引物進行PCR擴增，回收產(chǎn)物及載體，經(jīng)BamHⅠ和PstⅠ酶切后通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR及酶切驗證；將載體中的CaMV35S啟動子置換為2E＋35S啟動子，載體和pMD－2E＋35S都經(jīng)XbaI和HindⅢ雙酶切，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR及酶切驗證；然后添加Ω增強子序列，載體和pMD－Ω經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR驗證；最后添加長度為100bp的poly（A）與NOS串聯(lián)序列。載體和pMD－Nos－poly（A）經(jīng)KpnⅠ和SphⅠ雙酶切，分別回收載體大片段和Nos－poly（A）片段，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR及酶切驗證。對驗證結(jié)果正確的質(zhì)粒進行測序，獲得HA－LTB融合植物表達載體如圖1。

圖1 融合植物表達載體HA－LTB結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Flow chart of the construction of HA－LTB vector

1.2.2 百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化 將攜帶目的載體的農(nóng)桿菌LBA4404涂板，挑取單菌落，28℃搖床振蕩培養(yǎng)以活化菌體，使細菌達到對數(shù)生長期（OD600為0.5～0.6）。8000r/min離心10min，菌體用 MS液體培養(yǎng)基重懸，使OD600為 0.5～0.6［20］。

取播種后約8d的百脈根幼苗，以百脈根子葉作為外植體在子葉柄部位剪切，放入培養(yǎng)皿中。將混均勻的菌液倒入放有子葉的培養(yǎng)皿中，浸泡30min。然后將其中的子葉轉(zhuǎn)入有濾紙的MS培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3～4d，將暗培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到加抗生素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)約1周。轉(zhuǎn)移到MS＋Cef 100mg/L的生根培養(yǎng)基上。每兩周換一次新的培養(yǎng)基，快速生根，直至成苗［21］。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因百脈根的分子檢測 再生植株PCR分子檢測，根據(jù)HA和LTB基因全長序列設計特異引物（表1），以再生百脈根植株基因組為模板，按以下體系進行PCR反應：在20μL PCR反應體系中加入12.75μL dd H2O，2μL 10×buffer，2μL dNTP，基因上下游引物各1μL，ExTaq酶0.25μL，1μL模板；反應程序為：94℃預變性5min，然后94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

轉(zhuǎn)基因植株的RT－PCR檢測，參照“通用植物總RNA提取試劑盒”說明進行百脈根RNA的提?。喊凑誌nvitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應。

轉(zhuǎn)基因植株的ELISA檢測，百脈根總可溶性蛋白的提?。撼瑑襞_內(nèi)取100mg轉(zhuǎn)基因百脈根葉片放入2.0 mL Ep管中，迅速置于液氮內(nèi)，打樣機上破碎，加入500μL蛋白提取液，室溫12000r/min離心10min，取上清，即為百脈根總可溶性蛋白粗提液，用于考馬斯亮藍蛋白定量；LTB蛋白的定量依照大腸桿菌熱敏毒素B亞基酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效植物表達載體的構(gòu)建

2.1.1 添加KDEL序列 在已有載體pCAMBIA2301－PMI－MARs和HA－LTB融合基因的基礎上，通過引物設計在LTB后添加KDEL序列。利用HA－BamHⅠ引物和LTB－KDEL－SalⅠ/PstⅠ引物（表1）以構(gòu)建載體質(zhì)粒為模板進行PCR驗證，得到1條長約2000bp的條帶，采用BamHⅠ和PstⅠ對構(gòu)建好的植物表達載體進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳得到1條約2000bp的條帶。PCR及酶切驗證表明插入基因片段與HA－LTBKDEL序列2062bp大小相符，且測序結(jié)果與HA－LTB－KDEL序列也完全匹配，載體已正確插入KDEL序列。

2.1.2 置換啟動子 將載體pCAMBIA2301中的CaMV35S啟動子置換為2E＋35S啟動子。已構(gòu)建載體經(jīng)XbaI和HindⅢ雙酶切，經(jīng)PCR及酶切驗證，結(jié)果表明PCR及酶切獲得1條長約700bp的條帶，與785bp的2E＋35S啟動子大小相符，將驗證結(jié)果正確的質(zhì)粒進行測序，且測序結(jié)果與2E＋35S啟動子序列也完全匹配，載體已正確插入2E＋35S啟動子序列。

2.1.3 添加Ω增強子序列 在已有載體pCAMBIA2301－PMI－MARs基礎上添加Ω增強子序列，經(jīng)PCR及酶切驗證，結(jié)果表明PCR獲得1條長約100bp的條帶與75bp的Ω增強子序列大小相符，將驗證結(jié)果正確的質(zhì)粒進行測序，且測序結(jié)果與Ω增強子序列也完全匹配，載體已正確添加Ω增強子序列。

2.1.4 添加多聚poly（A）序列 已構(gòu)建載體經(jīng)KpnⅠ和SphⅠ雙酶切，經(jīng)PCR及酶切驗證，結(jié)果表明PCR及酶切獲得1條長約500bp的條帶與poly（A）－Nos大小相符，將驗證結(jié)果正確的質(zhì)粒進行測序，且測序結(jié)果與poly（A）－Nos序列也完全匹配，載體已正確插入poly（A）－Nos序列。

通過對已構(gòu)建載體進行PCR、雙酶切鑒定及測序驗證，結(jié)果表明載體已正確插入MHA－MLTB－KDEL序列、2E＋35S啟動子、Ω增強子序列、poly（A）－Nos序列，證明HA－LTB融合表達載體構(gòu)建成功。

2.2 百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化

參照實驗室已建立的以磷酸甘露糖為篩選標記的百脈根安全高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，以百脈根七日齡苗子葉（含下胚軸）為外植體，農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化百脈根，經(jīng)暗培養(yǎng)，分化培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)，最終獲得抗性植株91株（圖2）。

2.3 轉(zhuǎn)基因百脈根的分子檢測

2.3.1 PCR檢測 獲得百脈根抗性植株后，提取其基因組DNA，分別進行HA及LTB基因PCR檢測，結(jié)果顯示共獲得21株轉(zhuǎn)基因陽性百脈根植株，轉(zhuǎn)化率達到23.1%，檢測結(jié)果分別如圖3－1和圖3－2。

圖2 百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Genetic transformation of L.corniculatus

圖3 轉(zhuǎn)基因百脈根PCR檢測Fig.3 PCR assay of transgenic L.corniculatus

2.3.2 RT－PCR檢測 為驗證PCR陽性百脈根植株中HA及LTB基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達，提取轉(zhuǎn)基因植株總RNA，按照Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，并對cDNA進行PCR檢測，結(jié)果如圖4和5，說明HA及LTB基因在mRNA水平成功表達。

圖4 HA基因RT－PCR檢測Fig.4 RT－PCR of HA gene

圖5 LTB基因RT－PCR檢測Fig.5 RT－PCR of LTB gene

2.3.3 ELISA檢測 將濃度分別為0.1mg/mL的牛血清白蛋白標準品（BSA）進行倍比稀釋，在595nm吸光值下繪制BSA蛋白標準曲線。利用蛋白提取液提取轉(zhuǎn)基因百脈根植株的總可溶性蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍染色后，測定其在595nm下的吸光值，并帶入BSA蛋白標準曲線，計算轉(zhuǎn)基因百脈根中總可溶性蛋白濃度。采用蛋白定量中同樣的方法，將LTB標準品進行倍比稀釋，進行LTB酶聯(lián)免疫反應，繪制LTB標準曲線（圖6），計算LTB抗原蛋白濃度。最終計算出21株陽性百脈根總可溶性蛋白中LTB抗原蛋白的含量（圖7），其中12號百脈根LTB表達量最高，達到0.086μg/mg（蛋白粗提液），結(jié)果表明LTB與HA蛋白融合不影響各自蛋白的免疫活性，LTB表達量最高達到0.086μg/mg（蛋白粗提液），HA抗原蛋白的分子量是LTB的3倍，由此可以推算出HA在百脈根中的最高表達量約為0.25μg/mg（蛋白粗提液）。

圖6 LTB蛋白標準曲線Fig.6 Standard curve of LTB protein

圖7 轉(zhuǎn)基因百脈根中LTB蛋白含量Fig.7 LTB content in transgenic L.corniculatus

3 討論

選擇一個最佳啟動子高表達整合到植物中的外源基因是構(gòu)建高效植物表達載體的一項重要工作。CaMV35S啟動子因其強表達和組織特異性表達特點而被廣泛應用于雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。在CaMV35S啟動子的－46至－105序列中含有增強子序列，將CaMV35S啟動子的－46至－105序列中含有增強子元件重復串聯(lián)，構(gòu)建雙35S啟動子，可顯著提高外源基因的表達水平［11－12］。Wally等［22］研究結(jié)果表明D35s啟動子的表達量相比于CaMV35S啟動子平均提高了3～10倍，進一步表明添加雙35S啟動子有助于提高外源基因及外源蛋白表達量。

真核基因的5′－3′－非翻譯序列（UTR）對保持mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平有重要的作用。Gallie等［23］研究結(jié)果表明在5′端添加Ω元件能提高基因的翻譯效率。朱禎［24］報道煙草花葉病毒（TMV）的126ku蛋白基因的Ω因子（63bp）的存在可以使Gus RNA的轉(zhuǎn)譯活性提高數(shù)十倍。毛立群和郭三堆［25］將pBI121GUS基因的3′端插入了長度分別為25，50及100個dA殘基的poly（A）序列并轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)GUS基因的活性分別提高了27，37和47倍，表明poly（A）序列的長短與翻譯水平呈相關。Shapiro等［26］和Gallie等［23］分別報道稱poly（A）尾巴對轉(zhuǎn)錄后翻譯起增強作用，且增強的程度與poly（A）尾巴的長度正相關。因此，添加5′－3′－非翻譯序列在一定程度解決外源基因在植物體內(nèi)表達量低和穩(wěn)定性差的問題。

引導肽可以利用分泌途徑將外源蛋白引向特定的部位，從而提高重組蛋白的積累水平。外源基因的表達產(chǎn)物會受細胞內(nèi)的蛋白酶的降解，而在接入引導肽序列則會及時對蛋白進行定位，還可以提高蛋白的含量。Wandelt等［27］將編碼豌豆（Pisumsativum）種子VICILIN蛋白的基因和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號KDEL的編碼序列連接轉(zhuǎn)化植物，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草和紫花苜蓿（Medicagosativa）中帶有KDEL序列的蛋白含量分別是對照的20和100倍。Sojikul等［28］及Thanavala等［29］均證明在重組蛋白C－添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列KDEL，可以增加外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累水平，從而提高外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量。因此構(gòu)建含KDEL序列的表達載體可能對提高外源蛋白的穩(wěn)定性和積累水平有一定作用。

為提高禽流感血凝素表達量，本研究利用已有的HA－LTB融合基因，通過設計和添加多種調(diào)控元件，即雙增強子CaMV35S啟動子、Ω序列、加長poly（A）序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL序列等，經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定，證明HA－LTB融合基因高效植物表達載體構(gòu)建成功。利用農(nóng)桿菌介導方法轉(zhuǎn)化百脈根，獲得抗性植株91株，經(jīng)PCR，RT－PCR檢測，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株21株。通過夾心ELISA檢測，結(jié)果表明LTB最高表達量達到0.086 μg/mg（蛋白粗提液），HA最高表達量達到0.25μg/mg（蛋白粗提液），即占總可溶性蛋白的0.025%，顯著高于Guo等［30］于2012年報道的HA抗原蛋白表達量為總可溶性蛋白的0.00786%，已接近國際先進水平。本研究通過載體的設計和構(gòu)建大幅度提高了禽流感血凝素在百脈根中的表達量，實現(xiàn)了外源抗原蛋白在豆科牧草百脈根中的高水平表達，為動物實驗及禽流感可飼用疫苗的研究奠定了基礎。

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