李鵬飛， 李志鵬， 于婷， 李雪， 崔承弼*

( 1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)長白山生物資源與健康產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)別名刺芹側(cè)耳，為擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)擔(dān)子菌綱(Basidio-mycetes)層菌亞綱(Hymenomycetes)無隔擔(dān)子菌亞綱(Hom-obasidiomycetidae)傘菌目(Agaricales)側(cè)耳科(Pleurotaceae)側(cè)耳屬(Pleurotus)食用菌，其菌肉因具有杏仁味和鮑魚味而被稱杏仁鮑魚菇，簡稱杏鮑菇[1].杏鮑菇營養(yǎng)豐富，具有“平菇王”的美譽[2].資料[3-4]顯示，其干品含蛋白質(zhì)21.44%、游離氨基酸2.36%、甘露醇2.27%、灰分7.83%，其子實體和菌絲體的維生素C含量分別高達21.4 mg/100 g和13.9 mg/100 g；除此，杏鮑菇還含有豐富的鈣、鎂、銅、鋅等礦物質(zhì).研究[5]表明，杏鮑菇具有潤腸胃、降血脂、抗癌、美容、增強人體免疫力等作用，因此深受人們的喜愛.

杏鮑菇多糖(Pleurotuseryngiipolysaccharides，PEP)是一種從杏鮑菇子實體中提取出來的多糖，具有清除自由基、抗氧化、抗病毒、增強免疫力、抗腫瘤和抑菌等生理功能[6-9].Li Siqian等[10]研究表明，經(jīng)過磺化作用后的杏鮑菇多糖的抗氧化性能顯著提高，并且其抗菌作用也明顯提高，其中對大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌CMCC 26003的抑制效果最好.Alfred Mugambi Mariga等[11]從杏鮑菇中提取出了一種主要由精氨酸、絲氨酸和甘氨酸組成的分子量為63 kDa的新型蛋白質(zhì)，它能夠顯著抑制A549、HepG2等癌細胞的增殖，并能促進巨噬細胞的增殖，具有一定的免疫增強作用.Chen Jingjing等[12]的研究顯示，杏鮑菇多糖可以通過下調(diào)CD36基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達，抑制泡沫細胞中脂質(zhì)的積累，從而降低血脂和預(yù)防動脈粥樣硬化.Lin Jautien等[13]還研究了不同的杏鮑菇收獲時間對其抗氧化與抗炎能力的影響，實驗分別將子實體形成10,12,15 d的杏鮑菇采摘后進行成分的測定和抗氧化、抗炎能力的測定，結(jié)果顯示子實體形成10 d時杏鮑菇的酚酸、黃酮、生育酚和胡蘿卜素類物質(zhì)含量最高，且其抗氧化與抗炎能力也最強.楊立紅等[14]分離出了兩種具有生物活性的杏鮑菇多糖單體，其研究成果在我國尚屬首次.本文以杏鮑菇多糖為受試物，通過動物實驗研究其抗疲勞作用.

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼育條件

小鼠(24只)購于延邊大學(xué)實驗動物中心(健康雄性CL級KM種)，小鼠4 w齡，體重為(20±2) g；購買后于延邊大學(xué)食品研究中心動物室飼養(yǎng)，室溫為(24±2) ℃，相對濕度為45%～65%，及時供給食物和飲水，使其適應(yīng)1周后進行實驗.

1.2 樣品

新鮮杏鮑菇子實體購于吉林省圖們市石峴鎮(zhèn)延邊深山源生物技術(shù)有限公司.

1.3 儀器設(shè)備

主要儀器有：HK-168正方形調(diào)節(jié)式中藥切片機(廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司)；YZN-50煎藥機(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)；R202-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(常州諾基儀器有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；HA2000-A電熱油汀(慈溪市祥和電器有限公司)；FJ全模終端獨立送風(fēng)凈化籠具(蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備廠)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；U-3900分光光度計(日立儀器有限公司)；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；8O-2高速離心機(上海手術(shù)器械廠)；TG16A-WS離心機(上海盧湘儀器有限公司)；FA2004分析天平(上海上平儀器有限公司).

1.4 試劑

主要試劑有生理鹽水、95%乙醇溶液、5%三氯乙酸、硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、葡萄糖(分析純)、硫脲(分析純).蒽酮試劑用濃度為72%濃硫酸配制，其中加入蒽酮與硫脲的比例分別為0.05%和1%，配成后用錫箔紙包好存置冰箱中.

1.5 杏鮑茹多糖的制備

將稱取的4 kg新鮮杏鮑菇預(yù)處理后用切片機切成薄片，置于真空濃縮煎藥機中加入20倍體積濃度為70%的乙醇煎藥3 h，將擠壓出來的液體濃縮至2 000 mL后過濾；在濾液中加乙醇至70%醇沉[15]，抽濾后使濾渣溶于1 000 mL蒸餾水中，用Sevag法去蛋白(氯仿與正丁醇4∶1，0.5倍體積)，分層后取上層溶液加乙醇至70%；將濾出的沉淀低溫烘干后研磨成粉末，用蒸餾水配制成濃度分別為22.22，11.11，5.556 mg/mL的溶液，即杏鮑菇多糖低、中、高劑量.

1.6 實驗方法

1.6.1受試物劑量設(shè)計 將24只小鼠隨機分為對照組、低濃度杏鮑菇多糖溶液組、中濃度杏鮑菇多糖溶液組、高濃度杏鮑菇多糖溶液組，每組6只.楊娟等[16]在研究香菇多糖的抗疲勞作用時將其3種劑量分別設(shè)定為10,20，50 mg/(kg·d).故以香菇多糖高劑量為杏鮑菇多糖低劑量，將3個劑量分別設(shè)定為50，100，200 mg/(kg·d)，經(jīng)口灌胃攝入藥物，同時以相等體積蒸餾水作為空白組灌胃物.

1.6.2小鼠爬桿時間的測定 末次灌胃30 min后，對小鼠進行爬桿實驗，記錄其從放上爬桿架到滑落的時間間隔，爬桿時間為其3次累計時間[17].

1.6.3小鼠力竭性游泳時間的測定 在各組小鼠末次灌胃0.5 h后，將小鼠依次放置于游泳箱中，并將質(zhì)量為小鼠體重5%的鉛皮綁在小鼠尾部進行力竭性游泳實驗[18].游泳箱規(guī)格為90 cm×45 cm×45 cm，水深約35 cm，水溫為(25±1) ℃.小鼠的游泳時間為小鼠自游泳開始至力竭沉入水中死亡的時間[19].

1.6.4小鼠體重及臟器系數(shù)的測定 實驗過程中每3 d測一次小鼠的體重，解剖后測定各實驗劑量組小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟的濕重，并計算它們與單位體重(100 g)的比值[20].

1.6.5小鼠肝糖原和肌糖原儲備量的測定

1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.采用蒽酮法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.配制濃度分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液各100 mL，然后分別依次取2 mL標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液和10 mL蒽酮試劑于試管中，沸水浴15 min，冷卻后在620 nm波長下測定OD值.以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.回歸方程為y=2.360x+0.097.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2) 小鼠肝糖原和肌糖原含量的測定.小鼠力竭性游泳后立即解剖，將其后肢肌肉和肝臟取出后用生理鹽水漂洗再用濾紙吸干；精確稱量100 mg后肢肌肉和肝臟，取5%的三氯乙酸8 mL分別加入后肢肌肉和肝臟后研磨成勻漿，勻漿以3 000 r/min離心15 min.取1 mL上清液加入4 mL 95%的乙醇溶液，放置過夜使多糖完全沉淀析出，以3 000 r/min離心15 min；去上清液，控干10 min后，使糖原溶解于2 mL蒸餾水中.以同量蒸餾水為試劑空白.向各試管中分別加入10 mL蒽酮試劑，沸水浴15 min，在620 nm波長下測定吸光度[21].將各組試管的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)方程

肝/肌糖原含量(mg/100 g)=

其中OD為樣品管吸光度，2為溶解糖原時用的蒸餾水體積(mL)，V為提取液體積(mL)，m為肝臟/肌肉組織的質(zhì)量(g)，0.9為葡萄糖和糖原轉(zhuǎn)換系數(shù).

1.6.6統(tǒng)計方法 實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05時認(rèn)為有顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇多糖對小鼠體重的影響

杏鮑菇多糖對各組小鼠體重的影響如表1所示.由表1可知，對KM種小鼠連續(xù)灌胃4 w期間，各實驗劑量組小鼠的體重都顯示出了逐步增長的趨勢.用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)后再經(jīng)多重比較發(fā)現(xiàn)，各時間段各組小鼠體重之間不存在顯著性差異，這表明一段時間一定劑量杏鮑菇多糖的攝入未對小鼠的體重造成影響.

表1 杏鮑菇多糖對小鼠體重的影響

2.2 杏鮑菇多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響

杏鮑菇多糖對各組小鼠臟器系數(shù)的影響如表2所示.用SPSS 16.0軟件進行多重比較后發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的臟器系數(shù)之間不存在顯著性差異，這表明一段時間一定劑量杏鮑菇多糖的攝入未對小鼠的臟器系數(shù)造成影響，即說明杏鮑菇多糖在一段時間一定劑量下對小鼠臟器沒有顯著的損害.

表2 杏鮑菇多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響 g/100 g

2.3 杏鮑菇多糖對小鼠爬桿時間的影響

杏鮑菇多糖對小鼠爬桿時間的影響如表3所示.由表3可知，杏鮑菇多糖3個劑量組的小鼠爬桿時間與空白組比較均顯著增長，其中高劑量組與其他兩組間均有顯著性差異.這說明一定劑量的杏鮑菇多糖的攝入，能夠延長小鼠的爬桿時間.

表3 杏鮑菇多糖對小鼠爬桿時間的影響

注：相同字母的為差異不顯著，不同字母的為差異顯著；表4—表6同.

2.4 杏鮑菇多糖對小鼠力竭性游泳時間的影響

杏鮑菇多糖對小鼠力竭性游泳時間的影響如表4所示.由表4可知，杏鮑菇多糖3個劑量組的小鼠力竭性游泳時間與空白組比較也呈顯著增長，并且高劑量組的效果與其他兩組相比較均有顯著性差異.從實驗結(jié)果可知，一定劑量的杏鮑菇多糖的攝入，能夠顯著延長小鼠的力竭性游泳時間.

表4 杏鮑菇多糖對小鼠游泳時間的影響

2.5 杏鮑菇多糖對小鼠肝糖原儲備量的影響

杏鮑菇多糖對小鼠肝糖原儲備量的影響如表5所示.由表5可知，杏鮑菇多糖3個劑量組的小鼠肝糖原儲備量與空白組相比顯著增高，其中高劑量組效果與其他兩組相比較均有顯著差異，這說明杏鮑菇多糖的攝入能夠使小鼠的肝糖原儲備量顯著增加.

表5 杏鮑菇多糖對小鼠肝糖原儲備量的影響

2.6 杏鮑菇多糖對小鼠肌糖原儲備量的影響

杏鮑菇多糖對小鼠肌糖原儲備量的影響如表6所示.由表6可知，杏鮑菇多糖3個劑量組的小鼠肌糖原儲備量均顯著高于空白組，并且高劑量組效果與其他兩組相比較均有顯著差異.這說明一定時間一定劑量的杏鮑菇多糖的攝入，能夠提高小鼠的肌糖原儲備量，為小鼠的運動供能提供一定程度上的保障.

表6 杏鮑菇多糖對小鼠肌糖原儲備量的影響

3 討論

緩解體力疲勞的功能性食品評價方法包括運動耐力實驗和生化指標(biāo)測定.運動耐力實驗包括游泳實驗和爬桿實驗，生化指標(biāo)主要有血清尿素氮、肝糖原與肌糖原、血乳酸和乳酸脫氫酶活性等.一般認(rèn)為，不少于一項運動耐力實驗和不少于兩項生化指標(biāo)為陽性時，即可判定受試物具有抗疲勞活性[22].

爬桿時間和游泳時間的長短可以體現(xiàn)運動耐力的強弱.本實驗中，低、中、高3劑量組小鼠的爬桿時間和游泳時間均顯著長于空白對照組，其中以高劑量組效果最為明顯，說明一段時間一定劑量杏鮑菇多糖的攝入增強了小鼠的運動耐力.

肌肉活動時，能量的主要來源是糖類，人體內(nèi)的糖類主要有血糖、肝糖原、肌糖原3種.由于血糖在血液中可以直接轉(zhuǎn)化為ATP，所以其為最直接的供能物質(zhì)，長時間的劇烈運動，使得血糖水平降低，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)供能不足，這可能是導(dǎo)致疲勞的重要原因之一[23].血糖水平降低后，其平衡依賴肝糖原和肌糖原分解生成的葡萄糖進入血液來維持.由于肌肉中缺乏葡萄糖磷酸酶，肌糖原分解生成的葡萄糖不能直接到達血管，只能先通過糖酵解生成丙酮酸，之后以丙氨酸的形式運輸?shù)礁闻K糖異生為葡萄糖，再通過血液循環(huán)為肌組織供能[24].持續(xù)運動導(dǎo)致肝糖原和肌糖原持續(xù)大量消耗，而最終出現(xiàn)低血糖，使得機體不能維持運動的繼續(xù)從而產(chǎn)生疲勞，因此肝糖原和肌糖原含量也是評價機體運動耐力的重要指標(biāo).

本實驗對比了實驗組和對照組小鼠力竭性游泳之后肝糖原和肌糖原的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇多糖3個劑量組(低、中、高)小鼠的肝糖原和肌糖原含量與空白組相比顯著增高，其中以高劑量組小鼠肝糖原和肌糖原增加最為顯著，且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng).這也是杏鮑菇多糖具有抗疲勞功能的原因之一.

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