岳成鶴，曹隨忠，李西睿，馮 沖，龍 川，余樹民，儲明星，潘登科

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2 中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

異種移植(Xenotransplantation)是解決人體組織器官移植來源短缺問題的潛在途徑之一，小型豬以其多方面的優(yōu)點為異種移植的發(fā)展提供了一個能夠規(guī)避靈長類供體先天不足的理想供體選擇[1-4]。然而，小型豬作為供體向靈長類進行異種移植時存在一系列排斥反應(yīng)，其中超急性排斥反應(yīng)(Hyperacute rejection，HAR)是異種移植早期發(fā)生的首要免疫障礙。HAR是由靈長類體內(nèi)預(yù)存的針對供體αGal表位的天然抗體介導(dǎo)產(chǎn)生的排斥反應(yīng)。供體GGTA1基因(α1,3 galactosyl transferase gene)的失活能夠減少絕大部分αGal表位的產(chǎn)生，從而基本阻斷HAR[5]。

利用同源重組(Homologous recombination，HR)制備哺乳動物基因敲除體細胞的效率非常低(10-7～10-6)[6-7]，而同源重組的鑒定通常依靠對相應(yīng)抗性基因的分子生物學檢測。若靶基因的缺失可導(dǎo)致細胞明顯的表型改變，則可利用表型差異來更為高效地篩選基因缺失細胞[8-9]，而且利用表型差異能夠篩選出多種因素導(dǎo)致的靶基因失活細胞[5]。

非靈長類動物細胞表面存在的αGal表位，主要由GGTA1基因表達產(chǎn)物α-1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(簡稱α1,3GT)產(chǎn)生。GGTA1基因失活將極顯著地減少細胞表面的αGal表位，通過一定的方法使αGal表位表達量的差異顯現(xiàn)出來，便可將GGTA1基因失活細胞分離開來。艱難梭菌毒素A (ClostridiumdifficileToxin A,TcdA)和植物凝集素GSI-B4(Griffonia simplicifolia-Isolectin B4)是2種能夠特異性結(jié)合αGal表位的藥物。利用TcdA特異性結(jié)合αGal表位的特性及其細胞毒性可以去除大量表達αGal的細胞[5]，從而使αGal表位缺失的細胞得到富集。將GSI-B4用異硫氰酸熒光素(FITC)或其他標識分子 (如生物素) 標記，可用于對αGal表位的特異性標記而獲知αGal表位的存在及表達量。目前,利用TcdA和GSI-B4對αGal表位的特異性作用，多個研究組均篩選獲得了GGTA1基因缺失細胞[5,7,10]。此外，磁激活細胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)技術(shù)應(yīng)用于GGTA1-/-細胞的分選也獲得了成功[10]。

本研究嘗試利用MACS、MACS聯(lián)合流式細胞術(shù)(Fluorescent activated cell sorting，F(xiàn)ACS)、TcdA聯(lián)合FACS等3種篩選方法，從經(jīng)過GGTA1基因同源重組載體轉(zhuǎn)染的GGTA1+/-五指山小型豬(Wuzhishan miniature pig，WZSP)GGTA1+/-胎兒成纖維細胞中篩選GGTA1-/-細胞，以建立穩(wěn)定的GGTA1-/-細胞篩選平臺，為GGTA1基因缺失五指山小型豬的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒 分離自GGTA1+/-五指山小型豬35 日齡再克隆胎兒的GGTA1+/-胎兒成纖維細胞系(233GKO-1-FF0、233GKO-2-FF0和233GKO-4-FF0)，啟動子缺陷型同源重組載體pBS-GGTA1-SKO(攜帶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，neo)及pBS-GGTA1-DKO(攜帶嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，puro)，均由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所基因與細胞工程室轉(zhuǎn)基因豬研究組構(gòu)建與保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 磁力吸附架，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀、MoFlo流式細胞儀(Beckman，美國)，Nucleofector II核轉(zhuǎn)染儀(Lonza)，細胞培養(yǎng)皿、70 μm細胞篩(BD，美國)，杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，F(xiàn)ITC conjugated GSI-B4、Biotin conjugated GSI-B4、Dynabeads?M-280 Streptavidin(Invitrogen，美國)，TcdA(ClostridiumdifficileToxin A，ENZO Life Science)。

1.2 GGTA1基因同源重組載體電轉(zhuǎn)染GGTA1+/-胎兒成纖維細胞

取凍存的GGTA1+/-胎兒成纖維細胞233GKO-1-FF0、233GKO-2-FF0、233GKO-4-FF0，解凍后接種到T25細胞瓶中，待細胞生長至亞匯合狀態(tài)時用1 g/L胰酶消化收集并計數(shù)，取106個細胞1 000 r/min離心5 min，去除上清液后用100 μL電轉(zhuǎn)染液重懸細胞，向細胞懸液中加入6～8 μg線性化的同源重組載體pBS-GGTA1-SKO或pBS-GGTA1-DKO，充分混勻后小心加入電擊杯中，按照Nucleofector II核轉(zhuǎn)染儀程序T016進行電轉(zhuǎn)染。經(jīng)電轉(zhuǎn)染的細胞接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿，用含有體積分數(shù)20 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后消化，按1∶3的比例(貼壁細胞，1皿傳3皿)傳代，經(jīng)3～6次傳代的細胞用于表型差異篩選試驗。

電轉(zhuǎn)染時，用線性化的同源重組載體pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO，按每100萬細胞6 μg載體的比例電轉(zhuǎn)染細胞系233GKO-1-FF0，所獲細胞分別命名為233SKO-1-N和233DKO-1-P；相同條件電轉(zhuǎn)染細胞系233GKO-2-FF0，所獲細胞分別命名為233SKO-2-N和233DKO-2-P。用線性化的同源重組載體pBS-GGTA1-SKO，按每100萬細胞8 μg載體的比例電轉(zhuǎn)染細胞系233GKO-4-FF0，所獲細胞命名為233SKO-4-N。

1.3 MACS分選和富集αGal表位缺失細胞

將1.2中所獲細胞233SKO-1-N、233SKO-2-N、233DKO-1-P擴大培養(yǎng)，1 g/L胰酶消化、收集細胞后用DPBS洗滌后，加入0.2 mg/mL Biotin conjugated GSI-B4溶液重懸細胞(每20 μL 重懸106個細胞)，冰上孵育30 min；完成孵育的細胞用DPBS洗滌，加入Dynabeads?M-280 Streptavidin懸液充分重懸，冰上孵育30 min；經(jīng)孵育的細胞-磁珠懸液置于磁力吸附架上吸附3 min，將細胞懸浮液吸入新的試管中，磁吸附過程重復(fù)3～5次。取少量完成磁吸附的細胞懸液進行細胞計數(shù)：細胞密度小于104mL-1時，取適量細胞進行克隆化培養(yǎng)；細胞密度大于104mL-1時，則將所有細胞收集混合擴大培養(yǎng)，用于流式細胞術(shù)分選。

1.4 TcdA富集αGal表位缺失細胞

將1.2中所獲細胞233DKO-2-P和233SKO-4-N接種至100 mm培養(yǎng)皿，細胞生長至亞匯合狀態(tài)時按1∶4傳代，培養(yǎng)2 d后采用2×10-3g/L的TcdA溶液處理。去除培養(yǎng)液用DPBS洗滌細胞后，每個100 mm培養(yǎng)皿加入5 mL TcdA溶液，置于38 ℃作用2～4 h，然后去除培養(yǎng)皿中的液體，加入DPBS洗滌。洗滌后向細胞培養(yǎng)皿中加入含體積分數(shù)10%～20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d換液1次。觀察培養(yǎng)皿中的細胞克隆狀態(tài)，若每個培養(yǎng)皿中形成的細胞克隆少于50個，則進行單細胞克隆培養(yǎng)與挑?。蝗裘笾行纬傻募毎寺≥^多，將細胞克隆混合擴大培養(yǎng)，進行流式細胞術(shù)分選。

1.5 流式細胞術(shù)分選αGal表位缺失細胞

將1.3和1.4中混合擴大培養(yǎng)獲得的細胞消化，DPBS洗滌，然后加入0.2 g/L 的FITC conjugated GSI-B4溶液重懸細胞(每20 μL重懸106個細胞)，冰上孵育30 min。完成孵育的細胞經(jīng)DPBS洗滌2次后，加入少量DPBS重懸，1 h內(nèi)上機進行流式細胞術(shù)分選。分選時在FSC-Pulse width和FL1-FL2同時設(shè)門篩選細胞大小合適的FITC陰性細胞群(即αGal表位缺失細胞；結(jié)果如圖1所示)。流式細胞術(shù)分析時采用FL1-Counts峰圖，判定依據(jù)是染色后細胞的平均相對熒光強度(FL1)，αGal表位陰性細胞FL1為80左右，αGal表位陽性細胞FL1則為200以上。

圖1 αGal表位缺失細胞的流式分選設(shè)門示意圖(233DKO-2-P)

1.6 細胞鑒定

經(jīng)MACS篩選獲得的單細胞克隆首先進行PCR鑒定，再利用FACS檢測細胞αGal表位，F(xiàn)ACS方法同1.5。MACS聯(lián)合FACS獲得的細胞集落和TcdA聯(lián)合FACS獲得的細胞集落只進行PCR鑒定。

同源重組載體pBS-GGTA1-SKO結(jié)構(gòu)見圖2，上、下游引物分別設(shè)計在其同源短臂和同源長臂上，跨重組第4外顯子的PCR產(chǎn)物長度為2 005 bp。基因重組試驗中，使用的同源重組載體pBS-GGTA1-DKO除抗性標記基因外，其余結(jié)構(gòu)(主要是同源長臂和同源短臂)與pBS-GGTA1-SKO相同，故可使用相同的PCR鑒定引物，但PCR產(chǎn)物長度不同，分別為2 005 bp和1 859 bp。

圖2 pBS-GGTA1-SKO載體結(jié)構(gòu)

用野生型WZSP胎兒成纖維細胞作陰性對照，而跨野生型第4外顯子的PCR產(chǎn)物長度為942 bp。GGTA1+/-細胞的跨第4外顯子的PCR產(chǎn)物則有2個：一是長度為942 bp野生型，二是長度為2 005 bp的突變型。

用pBS-GGTA1-SKO電轉(zhuǎn)染GGTA1+/-細胞，若能得到GGTA1-/-細胞，則其跨第4外顯子的PCR產(chǎn)物均為突變型，長度為2 005 bp，在電泳圖上表現(xiàn)為1條2 005 bp大小的亮帶。

用pBS-GGTA1-DKO電轉(zhuǎn)染GGTA1+/-細胞，若能得到GGTA1-/-細胞，則其跨第4外顯子的PCR產(chǎn)物均為突變型，長度分別為2 005 bp和1 859 bp，在電泳圖上表現(xiàn)為長度約2 005 bp和1 859 bp的2條亮帶。

用于PCR鑒定的細胞裂解后提取基因組DNA進行鑒定。PCR鑒定引物設(shè)計在跨抗性標記基因的同源長臂(3′)和短臂(5′)上，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其序列為：P1 5′-GGATGCTTCCTCTAGTCTGTGATG-3′；P2 5′-CTCTAGCCTACCCAGAACTGCAGAG-3′。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，滅菌ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 MACS法及MACS聯(lián)合FACS篩選GGTA1-/-細胞

經(jīng)免疫磁珠篩選和有限稀釋法培養(yǎng)，細胞系233SKO-1-N和233SKO-2-N分別得到5個和6個細胞克隆，233DKO-1-P未獲得單細胞克隆。經(jīng)PCR鑒定，上述11個細胞克隆中，1N-3M和1N-4M這 2個細胞克隆的基因型為GGTA1-/-(表1和圖3)，陽性率為18.2%。

1N-3M的FACS檢測結(jié)果見圖4。1N-3M細胞經(jīng)FITC標記的GSI-B4染色后，其FL1平均相對熒光強度為80左右，而GGTA1+/-細胞及GGTA1+/+細胞染色后FL1平均相對熒光強度為200左右，這表明篩選獲得的成纖維細胞克隆1N-3M αGal表位缺失(即GGTA1-/-)。

利用MACS聯(lián)合FACS篩選，細胞系233SKO-1-N、233SKO-2-N和233DKO-1-P 各得到1個單細胞克隆，但經(jīng)PCR鑒定這些細胞仍為GGTA1+/-細胞(表1)。233SKO-2-N獲得的單細胞克隆2N-4MF經(jīng) PCR鑒定，結(jié)果顯示2條電泳條帶分別位于約942 bp(野生型第4外顯子)和2 005 bp(含neo的突變型第4外顯子)，無1 859 bp大小的條帶(整合的puro)(圖5泳道2)，也是GGTA1+/-細胞。

表 1 MACS及MACS聯(lián)合FACS獲得細胞克隆的PCR鑒定結(jié)果

圖3 跨neo的細胞克隆PCR鑒定(部分結(jié)果)

圖4 流式細胞術(shù)分析GGTA1-/-細胞1N-3M的αGal表達量

2.2 TcdA聯(lián)合FACS篩選GGTA1-/-細胞

細胞233DKO-2-P和233SKO-4-N按1∶4比例傳代后的第2天用TcdA溶液處理，處理后經(jīng)10 d培養(yǎng)，來自233DKO-2-P和233SKO-4-N的細胞數(shù)量分別擴增至約0.9×107個和1.8×107個。上述細胞經(jīng)FACS篩選獲得3個細胞集落，分別是2P-1TF、4N-1TF和4N-2TF，經(jīng) PCR鑒定，這3個細胞克隆均無942 bp條帶而僅有2 005 bp條帶(圖5，表2)，表明2P-1TF、4N-1TF和4N-2TF均為GGTA1-/-細胞，陽性率為100%。

圖5 TcdA聯(lián)合FACS獲得細胞及2N-4MF細胞的PCR鑒定

表 2 TcdA聯(lián)合FACS獲得的細胞克隆基因型

3 討 論

利用MACS篩選獲得的11個細胞克隆，經(jīng)PCR鑒定有2個是GGTA1-/-細胞克隆，而MACS富集后聯(lián)合FACS獲得的3個細胞集落經(jīng)PCR鑒定均不是GGTA1-/-細胞克隆，TcdA富集后聯(lián)合FACS獲得的3個細胞集落經(jīng)PCR鑒定均為GGTA1-/-細胞克隆。結(jié)果表明，MACS或TcdA富集聯(lián)合FACS能夠高效地篩選出GGTA1-/-細胞。

GGTA1基因的蛋白表達產(chǎn)物α1,3GT是產(chǎn)生異種抗原αGal表位的主要原因，敲除GGTA1基因可以基本消除αGal表位[11-13]。本研究采用的GGTA1+/-細胞是具有雜合型GGTA1基因的細胞，GGTA1等位基因中的一個第4外顯子(89 bp)已經(jīng)被攜帶neo的同源靶向DNA序列(約2 005 bp)所替代而成為突變型GGTA1基因，即該GGTA1基因已經(jīng)失活[14]。由于豬是二倍體動物，GGTA1+/-細胞中具有正?；钚缘囊吧虶GTA1基因，其能夠表達α1,3GT使GGTA1+/-細胞表面表達αGal表位，而GGTA1-/-細胞的αGal表位缺失，這為利用αGal表位的表型差異篩選GGTA1-/-細胞的實現(xiàn)提供了可能。

五指山小型豬GGTA1單等位基因敲除(GGTA1+/-)的再克隆豬胎兒成纖維細胞在基于表型缺失的篩選之前，已經(jīng)過同源重組載體pBS-GGTA1-SKO(帶neo標記)或同源重組載體pBS-GGTA1-DKO(帶puro標記)的電轉(zhuǎn)染。本試驗設(shè)計與Phelps等[5]、Simonds等[15]采用的策略類似，但以下3個方面具有明顯的特色：①同源重組載體的抗性標記基因改換為puro，其目的一方面是探索在GGTA1單等位基因敲除細胞基礎(chǔ)上進一步同源重組的可能性，另一方面是試圖厘清GGTA1-/-細胞產(chǎn)生的原因，即這些細胞來自于同源重組還是細胞內(nèi)發(fā)生的雜合性缺失。結(jié)果顯示，利用帶puro標記的同源重組載體進行基因同源重組獲得的GGTA1-/-細胞克隆(2P-1TF)只有標記基因neo，而無puro，表明細胞克隆2P-1TF發(fā)生了雜合性缺失。而Phelps等[5]研究中未更換抗性標記，Simonds等[15]未在GGTA1單等位基因敲除細胞基礎(chǔ)上進行進一步同源重組。②使用TcdA富集GGTA1-/-細胞，而非直接獲得單細胞克隆。富集之后的細胞采用流式細胞分選直接獲得GGTA1-/-細胞，或者將流式細胞分選后的細胞用于有限稀釋法以獲取單細胞克隆，該方案使得GGTA1-/-細胞的篩選效果更加穩(wěn)定，并且事實證明是可行而高效的。③篩選GGTA1-/-細胞時對MACS的使用更加靈活：當富集效率高時采用有限稀釋法，而富集效率低時將富集后的細胞用于FACS。

利用同源重組載體pBS-GGTA1-SKO(帶neo標記)或同源重組載體pBS-GGTA1-DKO(帶puro標記)對GGTA1+/-細胞進行同源重組，這在一定程度上增加了GGTA1-/-細胞產(chǎn)生的概率，同時，轉(zhuǎn)染時采用改換抗性標記的同源重組載體,可以使產(chǎn)生的GGTA1-/-細胞能通過一定的手段區(qū)別其產(chǎn)生原因：①如果GGTA1-/-細胞GGTA1基因的缺失來自于雜合性缺失，則該細胞中1對等位GGTA1基因中第4外顯子均含neo基因；②如果GGTA1-/-細胞GGTA1基因的缺失來自于pBS-GGTA1-DKO(帶puro標記)的同源重組，則該細胞1對等位GGTA1基因中第4外顯子將分別含neo基因和puro基因，而此二者的標記基因可以用PCR鑒別。從細胞系233-DKO-1P篩選出的1個細胞集落2P-1TF經(jīng)PCR鑒定，其GGTA1基因第4外顯子只含neo基因，說明細胞集落2P-1TF中GGTA1基因的缺失原因是雜合性缺失，結(jié)果與Simonds等[15]和Fujimura等[10]的報道一致。本研究中，TcdA聯(lián)合FACS獲得GGTA1-/-細胞克隆的效率最高，達100%(3/3)，MACS篩選GGTA1-/-細胞克隆的效率也達到了18.2%(2/11)，高于Fujimura等[10]的報道：MACS篩選效率4.49 %(7/150)，TcdA聯(lián)合FACS篩選效率1.45 %(2/134)。上述結(jié)果表明，優(yōu)化的細胞表型篩選方案顯著提高了GGTA1-/-細胞的篩選效率。

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