冷　鳳，孔　鵬，謝新宇，鄧佩佩，宋　盼，李　梅，李　敏，孟雅娟

(微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050015)

近年來(lái)，廣譜抗生素的濫用及實(shí)體器官移植手術(shù)的廣泛開(kāi)展，導(dǎo)致了免疫抑制劑的大量使用，放化療和對(duì)免疫系統(tǒng)更具有侵害性的醫(yī)療方法的應(yīng)用，造成真菌感染人群顯著增加。棘白霉素類(lèi)抗真菌藥物是以真菌細(xì)胞壁為作用靶點(diǎn)，非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成，使細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞壁完全性破壞，從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞溶解死亡。而哺乳動(dòng)物缺乏該合成酶，故棘白霉素類(lèi)藥物對(duì)真菌細(xì)胞有較高的特異性，對(duì)人體正常細(xì)胞影響較小[1]。

阿尼芬凈(anidulafungin)是第三代棘白霉素類(lèi)半合成抗真菌類(lèi)藥物，是兩性霉素B的衍生物，由美國(guó)禮來(lái)制藥公司研發(fā)，2006年12月在美國(guó)上市[2]。棘白霉素B(echinocandin B)是棘白霉素系列中的重要類(lèi)型，通過(guò)脫酰基酶將棘白霉素B的?；鶄?cè)鏈切掉，生成棘白霉素B母核(echinocandin B nucleus)，再接上活性酯側(cè)鏈生成阿尼芬凈。

棘白霉素B母核為淺黃色粉末，在水、二甲基亞砜中易溶，在甲醇、乙醇中微溶，在氯仿中極微溶，在丙酮中不溶。分子式為C34H51N7O15，分子量為797.81。Boeck等[3]利用制備色譜技術(shù)分離出高純度的棘白霉素B母核，但處理量小，無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)棘白霉素B母核分離純化的報(bào)道較少。

聚合物納米微球是由苯乙烯/二乙烯基苯類(lèi)聚合而成的高分子聚合物，多為樹(shù)脂，在化工及制藥行業(yè)中應(yīng)用廣泛。聚合物納米微球已成為提取分離純化工藝中不可缺少的分離介質(zhì)之一。王慧娟等[4]采用聚合物納米微球分離莽草酸；李寧等[5]采用聚合物納米微球分離格爾德霉素；林毅等[6]采用聚合物納米微球制備高純度的達(dá)托霉素。作者采用聚合物納米微球?qū)酌顾谺母核粗提物進(jìn)行層析純化，并對(duì)層析條件進(jìn)行了優(yōu)化。該純化方法簡(jiǎn)單、易行、穩(wěn)定，層析介質(zhì)可反復(fù)多次使用，為該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

棘白霉素B母核粗提物(含量80%)，自制；Uni PS 30、Uni PSN 30、NM 100型聚合物納米微球，蘇州納微科技有限公司。

乙腈(色譜純)，美國(guó)Merck公司；冰乙酸、無(wú)水乙醇，北京化工廠。

中壓層析系統(tǒng)(C-601泵，C-615控制器，C-660收集器，C-635檢測(cè)器)，瑞士Buchi公司；LA-2010A型高效液相色譜儀(CUV-VIS檢測(cè)器，Easy3000工作站)，日本島津公司。

1.2　色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水∶三氟乙酸=4∶96∶0.02；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3　聚合物納米微球的篩選

取100 g聚合物納米微球用1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡2 h，純化水洗至中性，濕法裝柱(Φ∶H=1∶9，S=5.31 cm2)，純化水平衡系統(tǒng)。取1 g棘白霉素B母核粗提物用純化水溶解，上樣，然后分別用1%、3%、5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇洗脫，洗脫流速10 mL·min-1，收集洗脫液，每管20 mL。HPLC檢測(cè)洗脫液色譜純度，將主峰色譜純度(峰面積歸一法，下同)≥98%的洗脫液合并，計(jì)算洗脫收率。洗脫液冷凍干燥后，得到棘白霉素B母核。

1.4　洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

取1 g棘白霉素B母核粗提物用純化水溶解，上樣于Uni PS 30型聚合物納米微球?qū)游鲋謩e用1%、3%、5%的乙醇洗脫，洗脫流速10 mL·min-1，收集洗脫液，每管20 mL。HPLC檢測(cè)洗脫液色譜純度，將主峰色譜純度≥98%的洗脫液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.5　洗脫流速的選擇

取1 g棘白霉素B母核粗提物用純化水溶解，上樣于Uni PS 30型聚合物納米微球?qū)游鲋?，?%乙醇洗脫，分別以6 mL·min-1、8 mL·min-1、10 mL·min-1、12 mL·min-1、14 mL·min-1、16 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每管20 mL。HPLC檢測(cè)洗脫液色譜純度，將主峰色譜純度≥98%的洗脫液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.6　上樣量的選擇

分別取0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g棘白霉素B母核粗提物用純化水溶解，上樣于Uni PS 30型聚合物納米微球?qū)游鲋?，?%乙醇洗脫，流速12 mL·min-1，收集洗脫液，每管20 mL。HPLC檢測(cè)洗脫液色譜純度，將主峰色譜純度≥98%的洗脫液合并，計(jì)算洗脫收率。

2　結(jié)果與討論

2.1　聚合物納米微球型號(hào)的確定

以不同型號(hào)的聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)，分別用1%、3%、5%的乙醇洗脫，洗脫收率見(jiàn)圖1。

由圖1可知，Uni PS 30型聚合物納米微球?qū)游鼋橘|(zhì)對(duì)棘白霉素B母核的分離效果優(yōu)于其它兩種層析介質(zhì)。因此，選擇Uni PS 30型聚合物納米微球作為層析介質(zhì)。

圖1　不同型號(hào)聚合物納米微球?qū)酌顾谺母核的洗脫收率

2.2　洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

以Uni PS 30型聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)，分別采用1%、3%、5%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液體積和洗脫收率見(jiàn)表1。

表1不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫時(shí)洗脫液體積和洗脫收率

Tab.1Theelutionvolumeandyieldofdifferentvolumefractionsofethanol

乙醇體積分?jǐn)?shù)/%上樣量/g洗脫液體積/mL洗脫收率/%1163066　83145085　75126080　3

由表1可知:用1%乙醇洗脫時(shí)，洗脫液體積大，洗脫過(guò)程拖尾且洗脫收率低；用5%乙醇洗脫時(shí)，洗脫液體積小，洗脫速度過(guò)快，層析柱分離度低，主峰與雜質(zhì)之間不能有效分離，洗脫收率較低；用3%乙醇洗脫時(shí)，洗脫液體積適中，層析柱分離度較高，分離效果較好，洗脫收率高，洗脫液中棘白霉素B母核色譜純度較高。因此，確定洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%。

2.3　洗脫流速的確定

以Uni PS 30型聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)，用3%乙醇在不同洗脫流速下洗脫，洗脫收率見(jiàn)圖2。

由圖2可知，同樣條件下，洗脫流速不同，洗脫收率差異較大。洗脫流速較低(6 mL·min-1)時(shí)，分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，洗脫收率較低；洗脫流速過(guò)快(16 mL·min-1)時(shí)，主峰與雜質(zhì)之間不能充分分離，洗脫收率較低；當(dāng)洗脫流速為8～12 mL·min-1時(shí)，洗脫收率較高，均達(dá)到85%以上?？紤]單次實(shí)驗(yàn)時(shí)間，確定洗脫流速為12 mL·min-1。

圖2　不同洗脫流速下的洗脫收率

2.4　上樣量的確定

以Uni PS 30型聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)，用3%乙醇洗脫，流速為12 mL·min-1，采用不同的上樣量時(shí)的洗脫收率見(jiàn)圖3。

圖3　不同上樣量下的洗脫收率

由圖3可知，同樣條件下，上樣量過(guò)低時(shí)，樣品分散嚴(yán)重，洗脫體積較大，不易收集到高純度的洗脫液，洗脫收率較低；上樣量過(guò)大時(shí),主峰與雜質(zhì)峰重疊,造成洗脫液純度顯著下降，洗脫收率也較低。在保證分離度的前提下,選擇上樣量為0.8～1.2 g·(100 g介質(zhì))-1時(shí)，洗脫收率較高，均達(dá)到85%以上?？紤]單次實(shí)驗(yàn)處理量，上樣量選擇1.2 g·(100 g介質(zhì))-1為宜。

3　結(jié)論

以聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)分離純化棘白霉素B母核。結(jié)果表明，以Uni PS 30型聚合物納米微球?yàn)閷游鼋橘|(zhì)、上樣量1.2 g·(100 g介質(zhì))-1、以3%乙醇為洗脫液、流速12 mL·min-1時(shí)，得到純度大于98%的棘白霉素B母核，總收率大于85%。該分離純化方法簡(jiǎn)便、快捷可行，為該產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李岷,沈永年,呂桂霞,等.棘白菌素類(lèi)抗真菌藥[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2009,4(4):249-257.

[2]謝新宇.新型抗真菌藥阿尼芬凈的研究進(jìn)展[J].河北化工,2011,34(5):33-34.

[3]BOECK L D,FUKUDA D S,ABBOTT B J,et al.Deacylation of echinocandin B byActinoplanesutahensis[J].J Antibiot,1989,42(3):382-388.

[4]王慧娟,楊寧.聚合物納米微球分離純化莽草酸方法研究[J].河南科技,2014,12(1):58-60.

[5]李寧,張雪霞,李曉露,等.聚合物納米微球分離純化格爾德霉素方法研究[J].化學(xué)與生物工程,2011,28(7):74-77.

[6]林毅,張雪霞,李寧,等.聚合物納米微球分離純化達(dá)托霉素方法研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2013,38(8):588-592.