郭利，王煒，張淑琴，孫娜，王鳳雪，武華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所省部共建特種動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130112)

隨著我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易和養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展，牛系統(tǒng)性疾病時(shí)有發(fā)生且危害嚴(yán)重。研究表明，牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratorydisease complex，BRDC)是由于牛生產(chǎn)運(yùn)輸和早期斷奶造成的主要系統(tǒng)性疾病之一，由多個(gè)致病因子或病原包括應(yīng)激、病毒和細(xì)菌的共同作用引起[1，2]，其中病毒的潛在感染是造成該病的重要原因之一，也是導(dǎo)致牛呼吸道疾病的啟動(dòng)器。在牛呼吸道疾病中分離出的病毒主要包括牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPIV3)。這些病毒常常形成持續(xù)性感染，嚴(yán)重影響架子牛生長(zhǎng)及奶牛的產(chǎn)奶量和牛奶的質(zhì)量。BRDC相關(guān)病毒中曾在水貂、雪貂分離到IBRV。雪貂、家兔、新生臭鼬可被人工感染，雪貂與兔可產(chǎn)生與牛相似的癥狀。BVDV還可感染鹿等特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。本研究著重對(duì)BRDC相關(guān)病毒進(jìn)行了多重PCR方法的建立及采集的臨床樣本檢測(cè)研究。目前，對(duì)BRDC相關(guān)病毒的檢測(cè)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的血清中和試驗(yàn)方法以及多聯(lián)PCR方法[3]。由于BRDC存在潛伏感染和長(zhǎng)期排毒，血清中和試驗(yàn)方法操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本較高，并且局限在實(shí)驗(yàn)室操作，很難實(shí)現(xiàn)推廣和應(yīng)用；多聯(lián)PCR方法對(duì)BRDC相關(guān)病毒的檢測(cè)靈敏、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，更適合推廣應(yīng)用。目前多聯(lián)PCR方法在檢測(cè)時(shí)主要是針對(duì)BRSV、BVDV和BPIV3建立的PCR檢測(cè)方法[4～6]，由于IBRV基因組的GC含量高達(dá)72%，對(duì)PCR反應(yīng)的試劑及條件要求苛刻，同時(shí)，GC的高含量給同一體系同時(shí)檢測(cè)牛呼吸道疾病綜合征的4種病原帶來(lái)極大困難，而臨床往往會(huì)發(fā)生同時(shí)感染的情況。本研究旨在建立一種能同時(shí)檢測(cè)牛呼吸道疾病綜合征的4種病原的多重PCR檢測(cè)技術(shù)。

1 材料

1.1 病毒和細(xì)胞

IBRV LN01/08強(qiáng)毒株、BVDV毒株、BPIV3毒株、MDBK細(xì)胞(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室保存)；BRSV病毒(華威特北京生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng))。

1.2 主要試劑和儀器

MEM和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；馬血清和胎牛血清(Hyclone公司)；TPCK處理胰酶(Sigma公司)；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；DNA聚合酶(寶生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invotrizen生物技術(shù)公司)。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。分析軟件DNAStar。PCR反應(yīng)儀(Bio-BAD公司)。

1.3 樣品來(lái)源

采自安徽、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古4個(gè)省、自治區(qū)臨床樣品33份，其中，鼻拭子17份、血清5份、血液11份。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上登錄的IBRV gB基因全序列(登錄號(hào)：AJ004801)、BRSV N基因、BVDV 5′-UTR和BPIV3 N基因序列，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)了4對(duì)特異性引物。引物序列如表1。

表1引物序列

Table 1 Primer

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖

MDBK細(xì)胞用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)和傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用于病毒接種。取-70℃保存的BPIV3、BVDV及IBRV，接種單層MDBK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待90%細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收獲。反復(fù)凍融3次，收獲病毒。

2.3 病毒總RNA的提取

分別吸取反復(fù)凍融的BRSV、BPIV3和BVDV病毒液500μL，Trizol法提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 病毒DNA提取

取反復(fù)凍融的IBRV病毒液500μL，煮沸10min，8 000r/min離心5min，取上清液留存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 PCR引物的特異性及反應(yīng)條件優(yōu)化

2.5.1IBRV、BVDV、BRSV及BPIV3(RT)PCR反應(yīng)條件的建立分別用IBRV、BVDV、BRSV及BPIV3模板和對(duì)應(yīng)引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，總體系為：25μL，即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，模板2μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃～60℃ 15s，68℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，68℃總延伸10min。

2.5.2引物的特異性反應(yīng)總系為25μL，即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，引物對(duì)1μL，DNA模板2μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃ 15s，68℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。反應(yīng)體系中模板和引物見(jiàn)表2。

表2引物及模板

Table 2 Primer and template

注：+．體系中含有的模板；-．體系中不含的模板

Note:+．shows template positive;-．shows template negative

2.6 PCR敏感性鑒定

分別以不同濃度的IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性實(shí)驗(yàn)，其中，IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒的檢測(cè)濃度分別為10ng/μL～1.0pg/μL、10ng/μL～100pg/μL、10ng/μL～10pg/μL、10ng/μL～10pg/μL。

2.7 多重PCR檢測(cè)方法的建立

建立IBRV PCR檢測(cè)方法后，在反應(yīng)體系中加入BIPV3模板和引物后，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立BIPV3+IBRV 2重PCR方法；在此基礎(chǔ)上同理建立BIPV3+IBRV+BRSV 3重PCR方法及BIPV3+IBRV+BRSV+BVDV多重PCR檢測(cè)方法。多重PCR反應(yīng)體系為25μL。即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，引物P1～P8各0.5μL，反轉(zhuǎn)錄模板1.5μL，病毒DNA模板0.5μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃ 15s，68℃ 1min，30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2.8 PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析

將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定后陽(yáng)性菌液測(cè)序。

2.9 多重PCR方法臨床樣品檢測(cè)

來(lái)自臨床的33份樣品，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄和提取DNA共同作為模板進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 PCR引物的特異性鑒定

分別以IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒、組織提取物以及陰性對(duì)照(蒸餾水)為模板，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)引物的特異性。結(jié)果出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的306bp、600bp、130bp和422bp條帶，所有的陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出任何條帶；3種混合后的樣品加非特異引物則出現(xiàn)特異性引物相對(duì)應(yīng)的條帶，陰性對(duì)照(蒸餾水)則未擴(kuò)增出任何條帶。見(jiàn)圖1和圖2。

1-a.IBRV PCR擴(kuò)增結(jié)果；1-b.BRSV、BVDV、BPIV3 RT-PCR結(jié)果；M.DL2 000Marker

1-a.IBRV;1-b.BRSV,BVDV,BPIV3;M.DL2 000Marke

圖1IBRV、BVDV、BPIV3和BRSVPCR結(jié)果

Fig.1PCRresultsofIBRV，BVDV，BPIV3andBRSV

3.2 PCR引物檢測(cè)的敏感性實(shí)驗(yàn)

分別以不同濃度的IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的敏感性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒最低檢測(cè)濃度分別為1.0pg/μL、100pg/μL、10pg/μL、10pg/μL，見(jiàn)圖3。

1.DNA MARker2 000；2.IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3混合模板及對(duì)應(yīng)引物多重PCR檢測(cè)結(jié)果；3.IBRV陽(yáng)性對(duì)照；4.IBRV引物及BRSV、BVDV和BPIV3混合模板PCR檢測(cè)結(jié)果；5.BRSV陽(yáng)性對(duì)照；6.BRSV引物及IBRV、BVDV和BPIV3混合模板PCR檢測(cè)結(jié)果；7.BVDV陽(yáng)性對(duì)照；8.BVDV引物及IBRV、BRSV和BPIV3混合模板PCR檢測(cè)結(jié)果；9.BPIV3陽(yáng)性對(duì)照；10.BPIV3引物及IBRV、BVDV和BRSV混合模板PCR檢測(cè)結(jié)果；11.蒸餾水對(duì)照

1.DNA MARker2 000;2.multiplex PCR result of IBRV、BRSV、BVDV and BPIV3;3.IBRV positive control;4.BRSV、BVDV and BPIV3 templates with IBRV primer;5.BRSV positive control;6.IBRV，BVDV and BPIV3 templates with BRSV primer;7.BVDV positive control;8.BRSV,IBRV and BPIV3 templates with BVDV primer;9.BPIV3 positive control;10.BRSV,IBRV and BVDV templates with BPIV3 primer;11.negative control

圖2引物特異性檢測(cè)結(jié)果

Fig.2Specificitytestresult

3.3 多重PCR檢測(cè)方法的建立

同一體系中同時(shí)加入IBRV、BRSV、BVDV及BPIV3 4種模板及對(duì)應(yīng)引物，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了2重、3重及多重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.4 多重PCR方法臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法檢測(cè)33例臨床樣品結(jié)果表明，合并感染2種病毒較為多見(jiàn)，分別為BVDV和BRSV共感染、BPIV3和BRSV共感染、BPIV3和IBRV共感染。3種以上病毒混合感染未見(jiàn)(圖5)。

圖3 多重PCR引物檢測(cè)的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

M.MarkerDL2 000；1.IBRV和BPIV3 2重PCR檢測(cè)結(jié)果；2.IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3多重PCR檢測(cè)結(jié)果；3.IBRV、BRSV和BPIV3 3重PCR檢測(cè)結(jié)果

M.MarkerDL2 000;1.Duplex PCR result of IBRV and BPIV3;2.multiplex PCR result of IBRV,BRSV,BVDV and BPIV3;3.triplex PCR result of IBRV,BRSV and BPIV3

圖4多重PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4MultiplexPCRresult

a.BVDV和BRSV混合感染、BPIV3和IBRV混合感染；b.IBRV單純感染；c.IBRV單純感染，BVDV單純感染，BRSV與BVDV混合感染a.BVDV and BRSV mixed infection,BPIV3 and IBRV mixed infection;b.IBRV infection;c.IBRV infection,BVDV infection,BRSV and BVDV mixed infection

4 討論

牛呼吸道疾病綜合征是與牛呼吸道疾病相關(guān)的最嚴(yán)重的疾病。通過(guò)檢測(cè)可知，臨床上BVDV、BPIV3、BRSV和IBRV共感染現(xiàn)象最常見(jiàn)。所以快速、特異性檢測(cè)對(duì)確定疾病的病原體和控制疾病的發(fā)生十分關(guān)鍵。目前有很多分子檢測(cè)方法用于檢測(cè)病毒，然而，大多數(shù)的方法是檢測(cè)單一病原的PCR或?qū)崟r(shí)定量PCR，而且對(duì)研究設(shè)備的要求更高[7，8]；多重PCR比常規(guī)PCR具有明顯的優(yōu)越性，如更高的敏感性、特異性和高通量的檢測(cè)，更重要的是，其檢測(cè)快速且對(duì)設(shè)備要求較低，可應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)4對(duì)引物用于4種病毒序列的擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)的特異性和敏感性要求更高。雖然RNA病毒是高度可變的，但病毒基因組的保守區(qū)域均可以在BRSV、BPIV3和BVDV病毒基因組中發(fā)現(xiàn)；IBRV病毒屬DNA病毒，基因組相對(duì)穩(wěn)定，變異性小。實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)引物的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，它可以檢測(cè)4種病毒中的每個(gè)病原體，與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，確保了多重PCR方法的準(zhǔn)確性。

國(guó)內(nèi)、外學(xué)者建立了BPIV3和BVDV 2重，BVDV、BRSV和BPIV3 3重PCR檢測(cè)方法[9]。BRSV、BPIV3和BVDV 3種病毒均為RNA病毒，并且基因組中GC含量在均一水平，給同一體系內(nèi)同時(shí)鑒定提供了便利條件。由于IBRV是DNA病毒，其基因組GC含量高達(dá)72%，遠(yuǎn)高于其它3種病毒，給PCR鑒定帶來(lái)一定的困難。在本研究中，通過(guò)條件的優(yōu)化和反應(yīng)試劑的篩選，成功建立了同一反應(yīng)體系同時(shí)檢測(cè)IBRV、BVDV、BPIV3和BRSV 4種病毒的多重PCR檢測(cè)方法，克服了基因組本身對(duì)反應(yīng)條件的影響，突破了IBRV不能同時(shí)與BVDV、BPIV3和BRSV 3種病毒在同一體系內(nèi)反應(yīng)的技術(shù)瓶頸，該方法在爆發(fā)牛呼吸道疾病時(shí)臨床快速檢測(cè)與BRDC流行病學(xué)研究具有實(shí)際意義。

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