于營，郭靖，王志清，韓月喬，歐陽艷飛

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

傳粉是種子植物受精的必經(jīng)階段，個(gè)體的基因流以及群體的交配方式在很大程度上受花粉運(yùn)動(dòng)的影響[1]，從而影響后代的遺傳組成和適合度。傳粉生物學(xué)對(duì)生殖生物學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)和系統(tǒng)與進(jìn)化等研究具有重要意義[2]。

桔梗[Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC]為桔?？平酃俣嗄晟荼局参?。以干燥根入藥，具有開宣肺氣、祛痰排膿之功效[3]。目前，對(duì)白花桔梗和紫花桔梗比較方面的研究主要集中于種子、根部和地上部分性狀的比較以及藥理作用、氨基酸含量和總皂苷含量差異比較[4～9]，而對(duì)于傳粉生物學(xué)方面的比較研究還處于空白。本試驗(yàn)通過對(duì)白花桔梗和紫花桔梗傳粉生物學(xué)的比較研究，旨在揭示其傳粉生物學(xué)方面的差異，以期為桔梗新品種選育和桔梗資源保護(hù)及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究地點(diǎn)位于吉林省吉林市昌邑區(qū)農(nóng)業(yè)部長白山野生生物資源觀測(cè)站，地理坐標(biāo)為N44°04′13.63″、E126°04′34.39″，海拔302.74m；實(shí)驗(yàn)材料為觀測(cè)站里桔梗實(shí)驗(yàn)基地人工栽培的3年生白花桔梗和紫花桔梗。

1.2 花部形態(tài)特征參數(shù)的測(cè)量

在白花桔梗、紫花桔梗試驗(yàn)地，隨機(jī)選取20朵花，用游標(biāo)卡尺和直尺測(cè)量花冠長度、花冠寬、雄蕊長、花柱長度和子房長等與傳粉生物學(xué)相關(guān)的特征值。

1.3 花粉量和花粉/胚珠比值的測(cè)定

參考胡適宜[10]的方法，隨機(jī)選取即將開放的白花桔梗、紫花桔梗各10朵，每朵花取下全部花藥，置于含有0.5%亞甲基藍(lán)染液和去垢劑的乙醇溶液中，定容至4mL。搖勻后，取1μL懸浮液放在載玻片上，在顯微鏡下記錄花粉粒數(shù)，重復(fù)記數(shù)3次；用手術(shù)刀橫切子房并記錄胚珠數(shù)目。統(tǒng)計(jì)各花的單花花粉量、胚珠數(shù)，最后計(jì)算花粉/胚珠(P/O)比值。

參照Cruden[11](1977)P/O比值劃分繁育系統(tǒng)類型，P/O比值位于區(qū)間2.7～5.4時(shí)繁育系統(tǒng)為閉花授粉；18.1～39.0時(shí)為專性自交；31.9～396.0時(shí)為兼性自交；244.7～2 588.0時(shí)為兼性異交；2 108.0～195 525.0時(shí)為專性異交。即P/O比值降低意味著近交程度升高，P/O比值升高伴隨著遠(yuǎn)交程度上升。

1.4 花粉活力與柱頭可受性的檢測(cè)

1.4.1花粉活力測(cè)定用TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)法測(cè)定花粉活力[12]。隨機(jī)取不同發(fā)育時(shí)間段的白花桔梗花、紫花桔?；ǜ?0朵，將花粉撒在載玻片上，滴加2滴～3滴0.5% TTC溶液，再滴加2滴磷酸緩沖液，蓋上蓋玻片，將載玻片置于內(nèi)有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，37℃暗培養(yǎng)1h，顯微鏡下觀察載玻片中的10個(gè)視野。有活力的花粉粒被染成紅色，無活力的花粉粒為其自身的顏色，統(tǒng)計(jì)紅色花粉粒所占比例，計(jì)算平均值。

1.4.2柱頭可受性的檢測(cè)柱頭可受性測(cè)定方法采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[12]。取不同發(fā)育時(shí)間段(時(shí)間設(shè)置與花粉活力規(guī)定的相同)的柱頭浸入含有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22，體積比)的凹面載玻片的凹陷處。若柱頭具有可受性，則柱頭周圍呈藍(lán)色并有大量氣泡出現(xiàn)，反之亦然。根據(jù)氣泡多少和顏色的深淺來判斷柱頭可受性的強(qiáng)弱。

1.5 傳粉檢測(cè)

1.5.1風(fēng)媒傳粉檢測(cè)用重力玻片法檢測(cè)花粉散布的可能性及數(shù)量。于盛花期，在晴朗有風(fēng)的天氣隨機(jī)選取相鄰的植株2株～3株，在花粉上涂有0.5%亞甲基藍(lán)，在順風(fēng)方向距離中心株0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.5m、2.0m、2.5m、3.0m、4.0m、5.0m處分別布置涂有凡士林的載玻片，凡士林的涂抹面積為75mm×25mm，當(dāng)日8∶30時(shí)放置，16∶30時(shí)取回，顯微鏡下檢測(cè)載玻片上染色花粉的數(shù)量。

1.5.2蟲媒傳粉檢測(cè)在盛花期，于8∶00時(shí)隨機(jī)選擇相近的3株～5株白花桔梗、紫花桔梗定為中心株，將其花粉用1%番紅分別進(jìn)行染色，連續(xù)觀察3d，每天15∶30時(shí)對(duì)中心株旁邊的植株進(jìn)行觀察，若附近植株的柱頭落有染成粉紅色的花粉，即測(cè)量這個(gè)植株與中心株的距離。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，檢驗(yàn)相關(guān)變量間是否存在顯著性差異，用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花部綜合特征

桔梗為總狀花序，單生或數(shù)朵疏生，兩性花；花冠闊鐘形，花萼鐘狀，前端5裂，花瓣具清晰的脈紋，紫花桔梗尤為明顯；雄蕊5枚，極少數(shù)為6枚，與花冠裂片互生；柱頭棒狀，周圍被白色柔毛包圍；花絲淡黃白色；子房中下位，5室；花部數(shù)量性狀特征參數(shù)見表1。SAS方差分析結(jié)果表明，在α=0.05水平下，花冠寬有顯著性差異(F=5.13，P<0.05)；白花桔梗與紫花桔梗間花冠長、子房寬、裂片長、裂片寬、裂深、雄蕊長和雌蕊長均無顯著性差異。

表1白花桔梗和紫花桔梗花部形態(tài)特征的平均值

Table 1 Mean value of floral parameters of white flower P.grandiflorum and purple flower P.grandiflorum

注：表中不同字母表示差異顯著，P<0.01。Note:Different lowercase letters mean significant differenceP<0.01.

2.2 花粉/胚珠比值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。白花桔梗、紫花桔梗單花平均花粉數(shù)分別為5.86×105個(gè)和5.05×105個(gè)，胚珠分別為256.67和230.00，P/O比值分別為2 282.3和2 195.1，按照Cruden(1977)的標(biāo)準(zhǔn)，該物種的繁育系統(tǒng)屬于兼性異交類型。方差分析表明，這2個(gè)種群?jiǎn)位≒/O比值不存在顯著性差異(F=0.03，P>0.05)。

表2白花桔梗與紫花桔梗P/O比值的相關(guān)數(shù)值

Table2Therelatedtopollen-ovuleratiovalues(P/O)ofwhiteflowerP.grandiflorumandpurpleflowerP.grandiflorum

觀測(cè)項(xiàng)目Observationcontent單花花粉數(shù)(個(gè))Averagepollennumber胚珠數(shù)(個(gè))OvulenumberP/O平均值P/Ovalues繁育系統(tǒng)類型Typeofbreedingsystem白花桔梗(X)WhiteflowerP.grandiflorumaverages5.86×105256.672282.3兼性異交Facultativexenogamy紫花桔梗(X)PurpleflowerP.grandiflorumaverages5.05×105230.002195.1兼性異交Facultativexenogamy

2.3 花粉活力與柱頭可受性

桔梗在7月10日開始開花，從圖1可以看出，白花桔梗的花粉活力比紫花桔梗稍強(qiáng)，但無顯著差異；桔梗在開花前1h花粉已經(jīng)具有活力，白花桔梗、紫花桔?；ǚ刍盍Ψ謩e達(dá)到35.21%和38.33%左右，此時(shí)花藥為淡藍(lán)色；開花后，隨著花粉散出，花粉活力也逐漸上升；開花后6h已經(jīng)大量散粉，2種花粉活力均達(dá)到94%以上，花藥變?yōu)樯钏{(lán)色；開花后12h，白花桔?；ǚ刍盍σ恢北３衷?1.47%以上，而紫花桔梗比白花桔梗弱，花粉活力為76.59%；之后，花粉活力開始逐漸下降；開花36h之后，花藥逐漸萎蔫，花粉活力迅速下降，到開花后60h，花藥散粉殆盡，白花桔梗、紫花桔?；ǚ刍盍σ逊謩e降至3.12%和4.6%；72h以后幾乎采集不到花粉。白花桔梗和紫花桔梗都是在開放當(dāng)天花粉活力達(dá)到最大值，約為94%。

圖1 桔梗開花后不同時(shí)間花粉活力

桔梗柱頭可受性測(cè)定結(jié)果見表3。桔梗在開花前1h，白花桔梗、紫花桔梗柱頭都不具有可受性?；▌傞_放時(shí)，柱頭呈淡藍(lán)色，柱頭可受性較弱；花后4h，柱頭可受性迅速增強(qiáng)；花后8h～36h，柱頭呈深藍(lán)色，周圍有大量氣泡產(chǎn)生；其中，花后36h柱頭可受性最強(qiáng)；48h后柱頭變?yōu)榈{(lán)色，可受性減弱；72h花被片即將脫落，柱頭變?yōu)辄S褐色，此時(shí)柱頭不變色，完全檢測(cè)不到活性。從表3可以看出，白花桔梗與紫花桔梗柱頭可受性在開花后第2天均達(dá)到最強(qiáng)，第3天迅速下降，兩者無明顯差異。

表3白花桔梗與紫花桔梗的柱頭可受性

Table 3 Stigma receptivity of white flower P. grandiflorum and purple flower P. grandiflorum

注：-.柱頭不具可受性；+/-.部分柱頭具可受性；+.柱頭具可受性

Note:-.stigma have no receptivity;+/-.some stigma have receptivity;+.stigma have receptivit

2.4 傳粉檢測(cè)結(jié)果

2.4.1風(fēng)媒傳粉檢測(cè)結(jié)果白花桔梗、紫花桔梗花朵開放都屬于集中、密集型，檢測(cè)結(jié)果如表4。白花桔梗和紫花桔梗傳播花粉的有效距離分別為1.5m和0.8m，而且桔?；ㄐ虻母叨炔灰粯?，花序上的花開得參差不齊，這將有利于花粉通過風(fēng)傳落到自花柱頭和它花柱頭上。自然條件下，桔梗植株的間距很近，約為3cm～5cm，遠(yuǎn)小于風(fēng)媒傳播花粉的有效距離，所以，桔?？梢越柚L(fēng)媒作用完成近距離的異花授粉。因此，從風(fēng)媒效果來看，無論是白花桔梗還是紫花桔梗都可以借助風(fēng)散播花粉來進(jìn)行同花授粉和異花授粉。

表4白花桔梗與紫花桔梗風(fēng)傳花粉數(shù)量

Table 4 The pollen number of white flower P.grandiflorum and purple flower P.grandiflorum by wind

2.4.2蟲媒傳粉檢測(cè)結(jié)果(圖2) 白花桔梗、紫花桔梗蟲媒傳粉最遠(yuǎn)距離分別為9.8m和6.5m，白花桔梗比紫花桔梗的傳播距離遠(yuǎn)，無論是白花桔梗還是紫花桔梗，被檢測(cè)的花粉大多數(shù)在4m以內(nèi)，由此可以看出，昆蟲采蜜一般以就近原則趨近的趨勢(shì)。

圖2 白花桔梗、紫花桔梗蟲媒傳播距離百分比

3 討論

傳粉生物學(xué)是研究與傳粉事件有關(guān)的物種生物學(xué)特性及其規(guī)律的一門學(xué)科[1]?；ú刻卣鳌⒒ǚ?胚珠比、花粉活力和柱頭可受性以及花粉傳播距離都是傳粉生物學(xué)研究的重點(diǎn)[13]。植物花進(jìn)化的主要?jiǎng)恿碓从谥参锉旧砼c傳粉者的相互作用。

花部特征主要影響訪花者的行為和花粉傳遞機(jī)制，花部誘物和報(bào)酬與訪花者的覓食有重要關(guān)系，例如花色素的化學(xué)成分、花的氣味和花粉的營養(yǎng)成分對(duì)訪花昆蟲的視覺反應(yīng)、訪花行為、訪花者的覓食偏好等都有一定的影響[14]，因此，研究白花桔梗與紫花桔?；ú刻卣鲗?duì)桔梗傳粉生物學(xué)具有重要意義。

花粉胚珠在傳粉生物學(xué)中也是比較重要的，可以根據(jù)Cruden(1977)P/O比值來劃分繁育系統(tǒng)類型。從白花桔梗、紫花桔梗的P/O比值(2 282.3和2 195.1)和其它特征可以看出，兩者均屬于兼性異交繁育系統(tǒng)，都是以異交為主，少部分自交親和。

植物完成受精的前提必須是有活力的花粉到達(dá)具有可受性的柱頭。研究有活力花粉的供體時(shí)間對(duì)增強(qiáng)植物總的適合度是非常重要的，有活力花粉的供體時(shí)間與對(duì)后代貢獻(xiàn)的多少成正比，同時(shí)與雄性適合度也成正比；本研究表明，白花桔梗和紫花桔梗開花當(dāng)天活力最強(qiáng)，然后逐漸減弱，有活力花粉持續(xù)時(shí)間較長，這有利于桔梗植物間的相互傳粉；研究植物柱頭可受期也在很大程度上影響傳粉的成功率[13]。如果有活力的花粉落到不具有可受性的柱頭上，那么也不會(huì)完成受精。白花桔梗與紫花桔梗柱頭可受性極其相似，先是開花后逐漸上升，第2天柱頭開裂后活性達(dá)到最強(qiáng)，之后隨著柱頭脫落活力逐漸消失，兩者無明顯差異。因桔梗開花后花粉達(dá)到最高活力時(shí)間與柱頭達(dá)到可受性最強(qiáng)時(shí)間不統(tǒng)一，這是阻礙桔梗自花傳粉的主要因素之一；而且桔梗因開花次序不同，花開放時(shí)間不一，這為桔梗個(gè)體之間相互傳粉提供充足的原料和保障，同時(shí)驗(yàn)證了桔梗是以異交為主，少部分自交。

傳粉生物學(xué)中按傳粉媒介不同可分為生物傳粉和非生物傳粉，而蟲媒和風(fēng)媒是桔梗傳粉里的主要傳粉媒介。風(fēng)媒傳粉過程中能夠?qū)ǚ燮鸬竭^濾作用，排除不適合的花粉和塵埃，從而提高傳粉效率，風(fēng)速的大小和環(huán)境因素影響風(fēng)媒傳粉距離。白花桔梗的花粉傳播距離比紫花桔梗遠(yuǎn)，分別為1.5m和0.8m；蟲媒傳粉者能夠直接將花粉帶到柱頭上，作為桔梗的主要傳粉者，研究蟲媒在桔梗的傳粉距離能夠直觀地了解桔?；蚱鞯木嚯x，白花桔梗、紫花桔梗蟲媒傳播距離分別為9.2m和6.5m。

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