袁雪梅, 沈錦玉, 藺凌云, 潘曉藝, 姚嘉赟, 徐 洋, 尹文林, 郝貴杰，2

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001； 2. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

草魚(yú)是中國(guó)淡水養(yǎng)殖四大家魚(yú)之一，在其養(yǎng)殖過(guò)程中疾病頻發(fā)成為阻礙草魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)?；l(fā)展的瓶頸。在所有病原中，以草魚(yú)呼腸孤病毒(Grasscarpreovirus, GCRV)危害最大，導(dǎo)致?lián)p失嚴(yán)重。草魚(yú)出血病是一種高傳染性、高致死性的病毒性疾病，是中國(guó)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為突出的問(wèn)題之一[1，2]。

魚(yú)類(lèi)的免疫體系包括特異性免疫和非特異性免疫，在感染各種病原體初期，抗體尚未形成，主要靠非特異性免疫發(fā)揮功能。非特異性免疫受許多環(huán)境因子影響，溫度、攝食狀況、擁擠等因子國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道[3]，對(duì)病原微生物感染后魚(yú)體的變化研究多從病理學(xué)及激活抗原-抗體反應(yīng)的特異性免疫的角度進(jìn)行，較少有考察感染病原微生物對(duì)魚(yú)類(lèi)感染初期非特異性免疫功能方面的報(bào)道。本文以不同濃度的草魚(yú)呼腸孤病毒通過(guò)腹腔注射感染草魚(yú)，同時(shí)用草魚(yú)呼腸孤病毒細(xì)胞滅活苗免疫草魚(yú)，然后于不同時(shí)間取血及肝臟，通過(guò)測(cè)定酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力變化趨勢(shì)來(lái)研究病毒感染及疫苗免疫對(duì)草魚(yú)非特異性免疫功能的影響。以期為魚(yú)類(lèi)在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特異性免疫響應(yīng)研究提供可借鑒的手段，在魚(yú)類(lèi)的抗病分析、疾病預(yù)報(bào)等方面提供應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)魚(yú)

草魚(yú)呼腸孤病毒(JX2008)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。草魚(yú)腎細(xì)胞系(CIK)由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。用于本研究的草魚(yú)購(gòu)自浙江省淡水水產(chǎn)研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個(gè)體積約為300 L自動(dòng)充氣水循環(huán)系統(tǒng)圓柱形水缸中飼養(yǎng), 每缸放40尾，飼養(yǎng)2周，水溫保持( 26±1)℃，試驗(yàn)期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。

1.2 病毒培養(yǎng)、細(xì)胞苗制備及免疫注射

將保存于液氮中的JX2008病毒接種于長(zhǎng)成致密單層的CIK細(xì)胞，室溫下吸附1～2 h, 吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液(含3%FBS的DMEM)，28℃恒溫培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞形態(tài)，直至出現(xiàn)80%細(xì)胞病變，收取病毒液進(jìn)行滴度測(cè)定。病毒滴度按常規(guī)方法[4]進(jìn)行測(cè)定。將滴定好的病毒與甲醛溶液混合，甲醛的終濃度為0.2%，于28℃溫育72 h。然后接種于長(zhǎng)成致密單層的CIK細(xì)胞，觀察是否有細(xì)胞病變。

3組實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS222溶液(1 mg/L)麻醉，第1組G1為高濃度感染組，每尾草魚(yú)經(jīng)腹腔注射TCID50為1×106的草魚(yú)呼腸孤病毒0.1 mL，第2組G2為低濃度感染組，每尾草魚(yú)注射TCID50為1×103的草魚(yú)呼腸孤病毒0.1 mL，第3組G3為疫苗組，每尾草魚(yú)注射細(xì)胞滅活疫苗0.1 mL，第4組G4為每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水作為對(duì)照。

1.3 樣本采集

分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、2、7和14 d取樣，每組隨機(jī)選取4尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)。實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS222(1 mg/L)深度麻醉，尾靜脈采血1.0 mL。室溫靜置待其凝固，4℃冰箱靜置過(guò)夜，4000 r/min離心10 min，收集上層血清，用于ACP、AKP、MPO、SOD活性的測(cè)定。同時(shí)迅速剝離肝臟組織，濾紙吸干水分后稱(chēng)重，加入無(wú)菌生理鹽水于冰浴中勻漿，使?jié)舛冗_(dá)到0.1 g/mL，在4℃條件下，以3000 r/min離心10 min，除去沉淀后獲得草魚(yú)的肝臟組織提取液，并以其作為酶原液進(jìn)行酶活性測(cè)定，置于4℃冰箱中備用。

1.4 酶活力測(cè)定

組織蛋白含量的測(cè)定和ACP、AKP、SOD、MPO活力的測(cè)定，均采用南京建成生物公司提供的檢測(cè)試劑盒，相應(yīng)操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各組織中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。ACP及AKP活力測(cè)定均采用磷酸苯二鈉法。ACP活力單位定義為每克組織蛋白(或100 cm3血清)在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位(U/g或10-2U/cm3)。AKP活力單位定義為每克組織蛋白(或100 cm3血清)在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位(U/g或10-2U/cm3)。SOD活力采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 cm3反應(yīng)液(或1 cm3血清)中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位(103U/g或U/cm3)。MPO活力采用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定，活力單位定義為每克組織濕片在37℃的反應(yīng)體系中H2O2被分解1 μmol為1個(gè)酶活力單位。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。各處理組與對(duì)照組之間各項(xiàng)免疫指標(biāo)的差異用SPSS軟件(16.0)中的單向方差分析法(ANOVA)進(jìn)行分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性磷酸酶活力

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d血清中酸性磷酸酶活性結(jié)果見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明G1、G2組及G3組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)酸性磷酸酶活性有所變化，但是較對(duì)照組的差異均不顯著。不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d肝臟中酸性磷酸酶活性結(jié)果見(jiàn)圖2，各組肝臟中酸性磷酸酶活力大體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，其中G1組在第2 d極顯著低于對(duì)照組，第14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組；G2組在第1 d時(shí)顯著低于對(duì)照組；G3組在第1、14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，第7 d時(shí)顯著低于對(duì)照組。

圖1 不同處理組草魚(yú)血清中酸性磷酸酶活力的變化情況

注：*表示該組與對(duì)照組差異顯著(P< 0.05)；**表示該組與對(duì)照組差異極顯著(P< 0.01)，下同。

圖2 不同處理組草魚(yú)肝臟中酸性磷酸酶活力的變化情況Fig 2 The change of ACP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.2 不同處理組草魚(yú)血清及肝臟提取液中堿性磷酸酶活力

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d血清中堿性磷酸酶活性結(jié)果見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明G1組堿性磷酸酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第7 d時(shí)達(dá)到最高值，極顯著高于對(duì)照組，到第14天時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G2組堿性磷酸酶活力呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)，在第7 d時(shí)，極顯著高于對(duì)照組，到第14 d時(shí)，顯著低于對(duì)照組；G3組呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在第2、7 d時(shí)顯著高于對(duì)照組，到第14 d時(shí)顯著低于對(duì)照組。

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d肝臟中的堿性磷酸酶變化情況如圖4所示，G1、G2組堿性磷酸酶均呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢(shì)，其中G1組在第1、7 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組，到第14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G2組在第1、2、7 d時(shí)均極顯著高于對(duì)照組，在第14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G3堿性磷酸酶活力呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在第1、14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組，在第2、7 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組。

圖3 不同處理組草魚(yú)血清中堿性磷酸酶活力的變化情況Fig 3 The change of AKP activity in grass carp serum in different treatment groups/d

圖4 不同處理組草魚(yú)肝臟中堿性磷酸酶活力的變化情況Fig 4 The change of AKP activity in grass carp liver in different treatment groups

2.3 不同處理組草魚(yú)血清及肝臟提取液中髓過(guò)氧化物酶活力

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d血清中髓過(guò)氧化物酶活性結(jié)果見(jiàn)圖5。試驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)處理組的變化趨勢(shì)不盡相同。其中G1組髓過(guò)氧化物酶活性呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，在第1 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組，第2 d時(shí)顯著低于對(duì)照組；G2組呈先升高再下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，在第2 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組；G3組呈現(xiàn)升高降低再升高的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，在第1、2 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組，第7 d時(shí)顯著低于對(duì)照組。

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d肝臟中髓過(guò)氧化物酶活性結(jié)果見(jiàn)圖6，G1組髓過(guò)氧化物酶活性呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢(shì)，在第14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G2、G3組均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，其中G2組在第1 d時(shí)顯著低于對(duì)照組，第7、14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組，G3組在第7 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組。

圖5 不同處理組草魚(yú)血清中髓過(guò)氧化物酶活力的變化情況Fig 5 The change of MPO activity in grass carp serum in different treatment groups

圖6 不同處理組草魚(yú)肝臟中髓過(guò)氧化物酶活力的變化情況Fig 6 The change of MPO activity in grass carp liver in different treatment groups

2.4 不同處理組草魚(yú)血清及肝臟提取液中超氧化物歧化酶活力

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d血清中超氧化物歧化酶活性結(jié)果見(jiàn)圖7，G1組呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在第2 d的時(shí)候極顯著高于對(duì)照組，第7 d的時(shí)候顯著高于對(duì)照組，第14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G2組呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，第1 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G3組呈現(xiàn)先升高再降低再升高的趨勢(shì)，在第2、7 d時(shí)均極顯著高于對(duì)照組。

圖7 不同處理組草魚(yú)血清中超氧化物歧化酶活力的變化情況Fig 7 The change of SOD activity in grass carp serum in different treatment groups

不同處理組草魚(yú)在1、2、7、14 d肝臟中超氧化物歧化酶活性結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果顯示，G1組的先升高后降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，第1、2 d均顯著高于對(duì)照組，第7 d時(shí)極顯著高于對(duì)照組，第14 d顯著低于對(duì)照組；G2組呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，第1、2、7 d均顯著高于對(duì)照組，第14 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組；G3組呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比差異不明顯。

圖8 不同處理組草魚(yú)肝臟中超氧化物歧化酶活力的變化情況Fig 8 The change of SOD activity in grass carp liver in different treatment groups

3 討論

3.1 ACP作為溶酶體酶的重要組成部分，在魚(yú)類(lèi)等低等脊椎動(dòng)物及軟體動(dòng)物中，保證了溶酶體有效完成防御和消化的雙重功能。ACP活性程度可以判定巨噬細(xì)胞激活程度，同時(shí)反映機(jī)體的免疫機(jī)能狀況。郭偉榮等[5]發(fā)現(xiàn)鰻弧菌感染使花鱸血清中ACP活性顯著升高，證明花鱸的巨噬細(xì)胞被激活，抗應(yīng)激水平提升，增強(qiáng)了花鱸對(duì)病原微生物的抵御能力。馬騫等[6]用哈維氏弧菌感染條紋斑竹鯊后，其組織及血清中ACP總體呈現(xiàn)先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)，表明條紋斑竹鯊在感染哈維氏弧菌后，體內(nèi)的吞噬作用開(kāi)始受到抑制而后逐漸恢復(fù)并被大量激活。在本實(shí)驗(yàn)中，各處理組草魚(yú)肝臟中ACP活力呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，提示體內(nèi)的吞噬作用先受到抑制而后被激活，血清中ACP的活性均小于肝臟中ACP的活性，這與其它水產(chǎn)動(dòng)物及高等脊椎動(dòng)物ACP在不同組織中分布情況相同[7]。已有研究表明，應(yīng)激對(duì)魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫細(xì)胞具有抑制作用, 造成吞噬細(xì)胞的吞噬能力降低[8]。本實(shí)驗(yàn)中各處理組血清中ACP的活性有所變化，但是與對(duì)照組的差異均不顯著，可能是由于魚(yú)體的應(yīng)激抑制了吞噬作用，伴隨吞噬作用而釋放的水解酶并未被大量激活所致，但還需進(jìn)一步證實(shí)。

3.2 AKP主要分布于機(jī)體的肝臟，在正常情況下這些血清酶活性低且相對(duì)穩(wěn)定，是血細(xì)胞溶酶體的特征酶，會(huì)對(duì)異物產(chǎn)生水解破壞作用[9]。陳寅兒等[10]和郭偉榮等[5]證明鱸魚(yú)及花鱸在受到細(xì)菌感染后血清中AKP的含量上升。在本實(shí)驗(yàn)中各處理組草魚(yú)血清中的AKP均有上升趨勢(shì)，這一結(jié)果與前兩位研究結(jié)果相似。在第7 d的時(shí)候3個(gè)處理組活性均極顯著高于對(duì)照組，其中G1組活性最大，說(shuō)明AKP活性與刺激物濃度有一定關(guān)系。

3.3 MPO是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御的重要氧化酶之一[11,12]，和H2O2和鹵化物組成了抗細(xì)菌及其它微生物體系，在非特異性免疫中發(fā)揮極為重要的作用。髓過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫和氯化物反應(yīng)生成次氯酸鹽，后者可以與胺鹽反應(yīng)生成氯胺，在它的作用下使機(jī)體快速、強(qiáng)烈的殺滅微生物[5,13]。孫虎山等[11]發(fā)現(xiàn)免疫促進(jìn)劑及可促進(jìn)櫛孔扇貝血細(xì)胞中MPO的生產(chǎn)及向血清中釋放,免疫多糖可增強(qiáng)櫛孔扇貝血淋巴MPO活性，王宜艷等[12]發(fā)現(xiàn)中國(guó)對(duì)蝦口服復(fù)合免疫藥物后，血清中MPO活力明顯增高。王江勇等[14]發(fā)現(xiàn)雜色鮑感染病毒能促進(jìn)MPO在血細(xì)胞的產(chǎn)生并逐漸釋放進(jìn)血清中。本實(shí)驗(yàn)中，各處理組血清和肝臟中MPO活性大體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，說(shuō)明刺激物進(jìn)入魚(yú)體能促使MPO的產(chǎn)生和釋放，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，MPO活性受到抑制。

3.4 SOD能專(zhuān)一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組分而造成的機(jī)體損害。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物組織中SOD酶活性受有關(guān)物質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論不一致[7, 15-17]。郭偉榮等[5]用鰻弧菌感染花鱸后，實(shí)驗(yàn)組SOD活性與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，表明花鱸對(duì)鰻弧菌的體內(nèi)吞噬作用抑制和消除了自由基的形成，使SOD的活性變化不明顯，可以保持細(xì)胞免受損害，從而維護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。本實(shí)驗(yàn)中3個(gè)處理組SOD活性變化不盡相同，G1組無(wú)論血清還是肝臟中活性均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，分析其原因可能是感染初期機(jī)體內(nèi)吞噬作用產(chǎn)生活性氧，在活性氧誘導(dǎo)下SOD活力提高，此后SOD活力下降可能是隨著感染時(shí)間增長(zhǎng)，體內(nèi)吞噬作用的進(jìn)一步恢復(fù)并增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧, 但SOD清除活性氧的能力有限,同時(shí)魚(yú)體內(nèi)的氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)需要通過(guò)協(xié)調(diào)各種酶的變化以抵抗活性氧對(duì)機(jī)體的傷害，因此SOD活力受到抑制。G2組血清呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，肝臟呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，G3組血清呈現(xiàn)先上升再下降再上升的趨勢(shì)，肝臟呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，兩個(gè)處理組血清和肝臟中SOD活性變化趨勢(shì)均相反，但是這兩個(gè)組織中SOD活性總和除了第7 d趨于穩(wěn)定，表明體內(nèi)SOD活性維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

3.5 本文中所用的GCRV為弱毒株，高低濃度均未使草魚(yú)發(fā)病，剖檢內(nèi)臟未見(jiàn)明顯病變，從免疫學(xué)角度可以說(shuō)明GCRV進(jìn)入魚(yú)體起到弱毒疫苗的作用，文中高、低濃度GCRV及其細(xì)胞滅活苗對(duì)4種酶活影響不同說(shuō)明疫苗的種類(lèi)和疫苗的劑量都會(huì)對(duì)機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。

在養(yǎng)殖草魚(yú)的病害防治過(guò)程中，化學(xué)藥物和抗生素的使用對(duì)環(huán)境和食品安全存在著潛在的危害，這對(duì)水產(chǎn)病害防治技術(shù)研究提出了更高的要求，免疫防治成為目前研究的熱點(diǎn)之一，因此對(duì)草魚(yú)非特異性防御體系的認(rèn)識(shí)是非常必要的。本文著重從非特異性免疫的角度討論了病毒感染和疫苗免疫后，魚(yú)類(lèi)非特異性免疫體系所做出的反應(yīng)，為魚(yú)類(lèi)在感染病原微生物以及免疫疫苗后的非特異性免疫響應(yīng)研究提供參考。

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