榮曄婧，陳 強，史雨紅，陳 炯

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波315211)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(portunus)，是一種重要的大型海產(chǎn)經(jīng)濟蟹類，廣泛分布于中國、日本、朝鮮及馬來西亞群島等海域，它具有肉質(zhì)好、生長快、產(chǎn)量高等優(yōu)點，經(jīng)濟價值高，養(yǎng)殖利潤豐厚，隨著海水養(yǎng)殖的快速發(fā)展，三疣梭子蟹養(yǎng)殖已成為各沿海地區(qū)的主導(dǎo)養(yǎng)殖品種。

目前，三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的蟹苗主要還是依靠野生資源，但由于環(huán)境惡化、病害和過度捕撈導(dǎo)致野生資源急劇下降，嚴(yán)重限制了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。因此迫切需要對野生資源進(jìn)行保護，了解三疣梭子蟹的野生種群遺傳結(jié)構(gòu)，為開展優(yōu)良、抗逆品種的選育提供科學(xué)依據(jù)，保持中國三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。據(jù)報道，同工酶[2,3]、16S rRNA、線粒體DNA、COI、CR、ITS1基因片段序列分析[4-6]、隨機擴增多態(tài)性 DNA (RAPD)[7]、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)[8]、微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)[1,9,10]等技術(shù)均以廣泛應(yīng)用于研究三疣梭子蟹種群內(nèi)和種群間、或與其它相近物種之間的遺傳關(guān)系。但上述技術(shù)存在檢測位點少、篩選周期長、自動化程度低，需已知基因組序列信息等缺點。

多樣性芯片技術(shù)(diversity arrays technology, DArT)是一種新遺傳標(biāo)記技術(shù)，綜合了基因芯片、AFLP、PCR、分子克隆等技術(shù)[11]，不需已知基因組序列，因此十分適合研究非模式生物[12]。同時，它具有高通量和低成本的顯著特點，較好地克服了以往跑電泳凝膠為主的標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)量低、成本高、耗時長、自動化程度低以及依賴核酸序列信息等缺點[13]，是一種比較理想的遺傳標(biāo)記技術(shù)，已成功應(yīng)用于水稻、大麥和木薯等多種農(nóng)作物[11,13-16]和細(xì)菌[17]的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定研究。本研究先構(gòu)建三疣梭子蟹基因組代表性DNA文庫，從中擴增獲得基因組代表性DNA片段，用于點制多樣性芯片。再通過雜交獲得DArT標(biāo)記，重新點制多態(tài)性富集芯片，通過熒光信號強度轉(zhuǎn)換獲得0/1矩陣，從而分析5個三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性，以期為三疣梭子蟹野生種群保護及選育提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

本研究所用5個地理種群的三疣梭子蟹樣品，分別取自中國由南到北的5個不同區(qū)域：丹東(DD)、煙臺(YT)、青島(QD)、連云港(LYG)、寧波(NB)，分別代表黃海的鴨綠江口種群；渤海的萊州灣種群；會場野生種群；海州灣種群；東海的舟山種群。以上5個種群都于2011年取樣，所有樣品殼平均長度11.51 cm±1.22 cm，平均體重164.4 g± 19.7 g，雌雄比例1∶1?；铙w運回實驗室，取大螯于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌TOP10F’由實驗室保存，PstI、TaqI 、T4 DNA連接酶購自Takara公司，氨芐青霉素、X-gal、LB培養(yǎng)基、SSC、1 kb DNA ladder和SDS購自上海生工生物工程公司，DecaLabel DNA Labeling Kit購自Fermatas公司，ExpressHybTM雜交液購自Clontech公司，鮭精DNA購自Sigma公司，Cy3-dCTP和Cy5-dCTP購自GE公司。

1.2 基因組代表性DNA片段文庫構(gòu)建

方法參照J(rèn)accoud等[11]描述。采用酚-氯仿法提取基因組DNA，并將不同地理種群三疣梭子蟹基因組DNA等量混合。100 ng混合基因組DNA用PstI和TaqI進(jìn)行酶切。在T4 DNA連接酶作用下，純化的DNA連接上PstI特異性接頭(5’-CACGATGGATC CAGTGCA-3’與5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’退火而成)。連接產(chǎn)物作為模板用于后續(xù)PCR擴增，所用引物為DArT-PstI引物 (5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’ )[13]，反應(yīng)程序如下：94℃變性5 min；94℃ 變性30 s，53℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，72℃延伸反應(yīng)10 min。擴增產(chǎn)物克隆至載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’并涂布于含氨芐青霉素和X-gal的LB培養(yǎng)基上。

1.3 基因組代表性DNA芯片點制

從基因組代表性DNA文庫中隨機挑選單菌落，利用質(zhì)粒載體上的通用引物M13F-47和M13R-48對插入的DNA片段進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物用異丙醇沉淀。采用晶芯?SmartArrayerTM48 微陣列芯片點樣儀進(jìn)行芯片點制，同時在芯片上設(shè)置一系列陽性和陰性對照。

1.4 芯片雜交和清洗

各地理種群基因組DNA(50 ng)用酶切、加接頭、PCR擴增操作如上。各地理種群代表性基因組DNA片段用1倍體積異丙醇濃縮10倍，變性后用DecaLabel DNA Labeling Kit進(jìn)行Cy3標(biāo)記，加入含十堿基隨機引物的5×緩沖液、MixC、Cy3-dCTP、exo-Klenow fragment共2.1 μL，37℃孵育10 min后，加入dNTPs 0.4 μL，37℃孵育30 min，加入0.1 μL EDTA(pH值8.0)終止反應(yīng)。參考DNA為pMD19-T載體多克隆位點片段并進(jìn)行Cy5標(biāo)記。Cy3和Cy5標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物混合，再加入1 μL鮭精DNA(10 g/L)和50 μL ExpressHybTM雜交液混合后，96℃變性3 min，冰浴驟冷1 min。DArT芯片在紫外交聯(lián)儀中250 mJ交聯(lián)備用。雜交反應(yīng)在晶芯?雜交儀中進(jìn)行，65℃孵育過夜。雜交后先用0.3× SSC, 0.1% SDS 清洗1次，再用0.06× SSC清洗2次，離心甩干。

1.5 數(shù)據(jù)提取及處理

雜交后采用晶芯?LuxScanTM10K-A 雙通道激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，并用LuxScan3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取。若對應(yīng)的參考DNA雜交熒光強度較弱，則屬于壞點，棄之。質(zhì)量符合條件的探針，其對應(yīng)的熒光強度按照log[cy3target/cy5reference]進(jìn)行計算并均一化，利用模糊C-均值聚類分析法(模糊度為1.5)及ANOVA獲得0或1標(biāo)記矩陣。最后探針對應(yīng)的結(jié)果必須滿足：在90%的芯片中置信水平P>0.95(賦值概率采用聚類算法)；符合前述條件時，在某張芯片上如果P<0.95則標(biāo)記為缺失(×)。

1.6 5個三疣梭子蟹種群遺傳關(guān)系分析

1.6.1 多樣性芯片(discovery arrays) 在本研究中，首先從隨機挑取的2500個基因組代表性DNA文庫克隆中擴增候選DArT標(biāo)記，點制成多樣性芯片，每個點重復(fù)3次。此外，質(zhì)控包括探針結(jié)合質(zhì)控、陽性雜交質(zhì)控、陰性雜交質(zhì)控、空白。

1.6.2 多態(tài)性富集芯片(polymorphism-enriched arrays) 將篩選獲得的上述候選DArT標(biāo)記重新點制成多態(tài)性富集芯片，每個點重復(fù)3次。芯片共35行、27列，每個DArT標(biāo)記重復(fù)3次，每個點的位置用“行標(biāo)-列標(biāo)”表示。其中1-1～1-3為HEX探針結(jié)合質(zhì)控，1-4～1-18為陰性質(zhì)控，1-19～1-21為陽性質(zhì)控，1-22～1-27為空白，35-22～35-27為三疣梭子蟹陽性探針。

來自于5個三疣梭子蟹野生種群PstI/TaqI代表性片段與多態(tài)性富集DArT芯片雜交，并重復(fù)1次。依據(jù)上述數(shù)據(jù)處理原則，獲得穩(wěn)定的0/1矩陣。采用PHYLIP 3.695軟件的RESTDIST和NEIGHBOR程序，用Nei/Li方法計算遺傳距離并構(gòu)建非加權(quán)組平均法(UPGMA)系統(tǒng)發(fā)生樹[18]，用SEQBOOT程序進(jìn)行bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1000計算各分支的置信度[19]。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA代表性DNA文庫構(gòu)建

本研究中基因組DNA完整，純度高，無RNA污染(圖1A)。將5個三疣梭子蟹地理種群基因組DNA等量混合，PstI和TaqI完全酶切后純化(圖1B)。在T4DNA連接酶作用下，純化的DNA酶切片段與PstI特異性接頭連接。連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行后續(xù)PCR擴增(圖1C)。PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’，所得基因組DNA代表性DNA文庫滴度≥105，陽性克隆平均插入片段長度>500 bp(圖1D)，符合DArT芯片點制要求。

A：5個三疣梭子蟹地理種群基因組DNA，M—1 kb DNA ladder；A1—丹東，A2—煙臺，A3—青島，A4—連云港，A5—寧波；B：混合基因組DNAPstI和TaqI酶切檢測 (5 μL)；C：加pstI接頭后PCR擴增；D：基因組DNA代表性文庫插入片段電泳檢測結(jié)果，1～24—隨機選取的克隆。

圖1三疣梭子蟹基因組DNA代表性片段文庫構(gòu)建

Fig 1 The construction of genomic representations library

2.2 采用DArT芯片技術(shù)分析三疣梭子蟹不同地理種群的親緣關(guān)系

5個三疣梭子蟹地理種群經(jīng)多樣性芯片分型，初步篩選獲得313個DArT標(biāo)記，多態(tài)性效率為12.5%。5個三疣梭子蟹地理種群再次與多態(tài)性富集芯片雜交，獲得穩(wěn)定的0/1矩陣。數(shù)據(jù)分析顯示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2采用多態(tài)性富集芯片確定5個三疣梭子蟹地理種的群遺傳多樣性

Fig 2 Identification of genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab detected on the polymorphism-enrichedPstI/TaqI arrays

313個候選多態(tài)性標(biāo)記的多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.32～0.48，中間值為0.40，較高于隨機選擇的雙等位基因位點的多態(tài)信息含量。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示了5個三疣梭子蟹地理種群之間的遺傳關(guān)系，其中青島和連云港的種群最先成簇，再與寧波種群成簇(圖3)，這可能是由于青島和連云港都屬于黃海，寧波位于東海，黃海和東海兩個水域之間存在基因交流。

根據(jù)313個PstI/TaqI多態(tài)性標(biāo)記構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹圖，分叉處數(shù)值表示1000次重復(fù)抽樣所得到的置信度百分比，只顯示置信度50 %以上的數(shù)值。

圖3 5個三疣梭子蟹地理種群之間的遺傳關(guān)系

Fig 3 Genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab

重復(fù)性驗證先采用不同生長階段和不同環(huán)境的寧波地區(qū)三疣梭子蟹樣品制備6份PstI/TaqI代表性片段，每份樣品重復(fù)雜交1次。這個基因型雜交call rate為98%。重復(fù)實驗中2次賦值結(jié)果一致性為99.1%，絕大部分(96%)DArT標(biāo)記在不同的樣品雜交結(jié)果中賦值相同。其余4%在6個樣品雜交中結(jié)果不同，這可能是由于發(fā)育或環(huán)境造成了基因組甲基化不同。這些DArT標(biāo)記顯然不適合包含在基因分型芯片中。另外，重復(fù)性驗證還采用同一樣品不同個體的代表性DNA片段進(jìn)行雜交。3個樣品，每個樣品2個個體。結(jié)果顯示，兩個個體之間差異在0.7%～1.6%之間，這是個體遺傳異質(zhì)性造成的。

3 討論

本研究構(gòu)建的三疣梭子蟹基因組代表性DNA文庫滴度≥105，陽性克隆平均插入片段長度>500 bp。多樣性芯片包括2500個基因組代表性DNA，作為候選多態(tài)性DNA，雜交篩選獲得313個DArT標(biāo)記，多態(tài)性效率為12.5%。上述多態(tài)性標(biāo)記重新點制成多態(tài)性富集型DArT芯片，雜交顯示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以0/1矩陣數(shù)據(jù)格式，分析了5個三疣梭子蟹地理種群間的遺傳多樣性。

基因組復(fù)雜性降低方法決定了基因組代表性文庫的多態(tài)性效率。PstI和TaqI酶切組合是DArT技術(shù)中降低基因組復(fù)雜度常用組合，在已報道文獻(xiàn)中證明此組合能獲得更高的多態(tài)性效率[13,16]，本研究中采用該酶切組合構(gòu)建PstI和TaqI酶切，多態(tài)性效率為12.5%。對于遺傳變異小的生物，基于PstⅠ的基因組復(fù)雜性降低方法構(gòu)建的基因組代表性文庫的多態(tài)性效率甚至不到10%，因此改進(jìn)原有技術(shù)或者尋求新的基因組復(fù)雜性降低方法，提高文庫中差異片段的比例，對于提高DArT技術(shù)的效率非常重要[20]。此外，由于PstI是甲基化敏感限制性內(nèi)切酶[13]，所以基因組甲基化程度也將影響多態(tài)性效率。

PIC是DArT技術(shù)的一個重要指標(biāo)。Botsein[21]首先提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時，表明該遺傳標(biāo)記可提供豐富的遺傳信息；當(dāng)0.25

DArT技術(shù)已在農(nóng)作物的遺傳多樣性分析中得到有效應(yīng)用[11,13-16]。目前，該技術(shù)還尚未在水產(chǎn)動物中應(yīng)用。三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性分析主要是形態(tài)學(xué)方法、CR基因序列分析、SSR分子標(biāo)記技術(shù)。在形態(tài)學(xué)上，鴨綠江口、萊州灣、海州灣、舟山4個野生種群的三疣梭子蟹中，海州灣、舟山2個種群形態(tài)最為接近，鴨綠江口和萊州灣2個種群形態(tài)較為接近[23]。馮冰冰等[24]利用線粒體CR基因片段序列分析，表明青島、連云港、象山遺傳距離較近。李曉萍[22]采用SSR標(biāo)記技術(shù)對5個種群(舟山、海州灣、青島即墨會場、萊州灣、鴨綠江口)的野生三疣梭子蟹的遺傳多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，即墨會場和海州灣兩個種群遺傳距離最近，萊州灣種群與這4個種群的遺傳距離較遠(yuǎn)。Liu等[1]研究了山東半島5個地區(qū)三疣梭子蟹的遺傳結(jié)構(gòu)，表明煙臺和青島遺傳距離較遠(yuǎn)。此外，本研究顯示的結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，說明DArT技術(shù)準(zhǔn)確地反映了地理種群之間的遺傳多樣性。

綜上所述，本研究報道了一種高通量的DArT技術(shù)，可用于三疣梭子蟹遺傳多樣性分析，可獲得穩(wěn)定并明確的遺傳分型圖譜，將有助于三疣梭子蟹自然資源遺傳多樣性研究和開展優(yōu)良品種選育工作。

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