胡 謀，苗 亮，李明云，張 浩，王金華，王天柱，潘 娜

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211)

黃姑魚(Nibeaalbiflora)和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)分別屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenida)的黃姑魚屬(Nibea)和黃魚屬(Pseudosciaena)，都是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類[1]。鑒于這兩種魚類經(jīng)濟(jì)性狀有一定互補(bǔ)性，且繁殖季節(jié)重疊，馬梁等[2]開展了大黃魚♀×黃姑魚♂人工雜交試驗(yàn)，但雜交胚胎呈典型的單倍體癥狀，無(wú)法獲得存活魚苗。王德祥等[1]、Miao等[3]的研究均顯示黃姑魚精子可作為誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育的異源激活源。這些研究結(jié)果說(shuō)明黃姑魚和大黃魚的精子可能有較高的相似性，但二者在超微結(jié)構(gòu)上有何異同尚未見報(bào)道。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已研究了多種硬骨魚類精子的超微結(jié)構(gòu)，不僅可以為其繁殖生物學(xué)提供必要的信息，而且對(duì)于魚類分類也有一定的借鑒作用。本研究使用掃描電鏡(Scanning electron micrographs, SEM)和透射電鏡(Transmission electron micrographs, TEM)技術(shù)對(duì)黃姑魚和大黃魚兩種精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和比較，旨在為其繁殖生物學(xué)的研究和繁殖養(yǎng)殖的開展提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

于2012年4月從寧波象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司的海水網(wǎng)箱中取性成熟的黃姑魚和大黃魚雄魚，通過人工擠壓腹部獲取精液，PBS液稀釋并離心，棄去上清液，用2.5%戊二醛前固定。掃描電鏡樣品：經(jīng)前固定后，PBS漂洗，1%鋨酸后固定，再PBS漂洗，乙醇逐級(jí)脫水和叔丁醇脫水，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥、離子濺射后用Hitachi S-3400N型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。透射電鏡樣品：經(jīng)前固定后，漂洗，梯度乙醇脫水，Epoon812樹脂包埋，超薄切片后經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，用Hitachi H-7650型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 外部形態(tài)

黃姑魚和大黃魚精子均為鞭毛型精子，無(wú)頂體，均由頭部、中段和尾部3部分組成；精子頭部和中段界限不明顯，頭部近橢圓形；尾部(鞭毛)可分為主段和末段，主段較粗，至末端逐漸變細(xì)，最后消失成一點(diǎn)(圖 1-a，圖 2-a,)。經(jīng)測(cè)量，黃姑魚和大黃魚精子在全長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、頭寬、中段長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、尾徑等參數(shù)上均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

a—精子外觀(appearance of a spermatozoon)；b—精子頭部放大圖(enlarge figure of the spermatozoon head)；H—精子頭部(head of spermatozoon)；Mp—精子中段(midpiece of spermatozoon)；F—精子尾部(flagellum of spermatozoon)。

圖 1 黃姑魚精子外部形態(tài)

2.2 頭部

黃姑魚和大黃魚精子頭部形態(tài)相似，結(jié)構(gòu)基本相同。精子頭部均有背腹面之分，無(wú)頂體(acrosome)；細(xì)胞核呈腎形，位于腹面，細(xì)胞核中染色質(zhì)高度濃縮，形成致密的團(tuán)塊狀，在團(tuán)塊狀染色質(zhì)之間分布著松散不規(guī)則排布的染色質(zhì)纖維和位置不定的網(wǎng)絡(luò)狀間隙(圖 3-a，圖 4-a)。中心粒復(fù)合體(centriolar complex)位于頭部的背面，近端中心粒(preximal centriole)和遠(yuǎn)端中心粒(distal centriole)均為“9+0”微管結(jié)構(gòu)，二者的長(zhǎng)軸相互垂直，遠(yuǎn)端中心粒向后延伸出軸絲(圖3-a，圖4-a)。

a—精子外觀(appearance of a spermatozoon)；b—精子頭部放大圖(enlarge figure of the spermatozoon head)；H—精子頭部(head of spermatozoon)；Mp—精子中段(midpiece of spermatozoon)；F—精子尾部(Flagellum of spermatozoon)；EP—尾部末段(endpiece of the ta)。

圖2大黃魚精子的外部形態(tài)

Fig 2 Morphology of spermatozoon inPseudosciaenacrocea

a—精子縱切(Longitudinal section of sperm)；b—精子細(xì)胞核橫切(Cross section of nucleus)；c—精子中段橫切(Cross section of midpiece)；d—鞭毛縱切(Longitudinal section of flagellum)；e—鞭毛橫切(Cross section of flagellum)；PC—近端中心粒(proximal centriole)；DC—遠(yuǎn)端中心粒(distal centriole)；M—線粒體(mitochondrion)；F—鞭毛(flagellum)；N—細(xì)胞核(nucleus)； OM—袖套外膜(outer membrane of sleeve)；IM—袖套內(nèi)膜(inner memberane of the sleeve)；V—囊泡(vesicle)；MT—微管(microtubule;)；LF—側(cè)鰭(lateral fin)； AX—軸絲(axoneme)。

圖3黃姑魚精子的超微結(jié)構(gòu)

Fig 3 Ultrastructure of the spermatozoon inN.albiflora

2.3 中段

黃姑魚和大黃魚精子中段均包括線粒體和袖套(sleeve)兩部分。袖套位于頭部的最后端，呈筒狀(圖 3-c；圖 4-c)，袖套中有少量的囊泡(vesicle)(圖 3-b；圖 4-b)；線粒體呈圓形，一般有4～5個(gè)，彼此間不融合，圍繞軸絲呈環(huán)形排列(圖3-c；圖4-c)。

a—精子縱切(Longitudinal section of sperm)；b—精子細(xì)胞核橫切(Cross section of nucleus)；c—精子中段橫切(Cross section of midpiece)；d—鞭毛縱切(Longitudinal section of flagellum)；e—鞭毛橫切(Cross section of flagellum)；PC—近端中心粒(proximal centriole)；DC—遠(yuǎn)端中心粒(distal centriole)；M—線粒體(mitochondrion)；F—鞭毛(flagellum)；N—細(xì)胞核(nucleus)；IF—植入窩(implantation fossa)；OM—袖套外膜(outer membrane of sleeve)；IM—袖套內(nèi)膜(inner memberane of the sleeve)；MT—微管(microtubule;)；LF—側(cè)鰭(lateral fin)；AX—軸絲(axoneme)。

圖4大黃魚精子的超微結(jié)構(gòu)

Fig 4 Ultrastructure of the spermatozoon inPseudosciaenacrocea

2.4 尾部

黃姑魚和大黃魚精子均為單鞭毛，細(xì)長(zhǎng)，鞭毛起始于袖套腔中，尾部表面的質(zhì)膜形成不規(guī)則的短鰭，在尾部縱切面上呈波紋狀向兩側(cè)突出而成的側(cè)鰭(lateral fin)，橫切面上可見軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖3-e，圖4-e)；尾部末梢均變細(xì)(圖1-a，圖2-a)。

3 討論

硬骨魚種類繁多，生殖特點(diǎn)不盡相同，受精方式分為體內(nèi)受精和體外受精兩種類型。Jamieson等[4]將體外受精的硬骨魚類精子分為I型精子(鞭毛長(zhǎng)軸與細(xì)胞核底部垂直)和II型精子(鞭毛長(zhǎng)軸與細(xì)胞核橫向平行)，II型精子因在鱸形目中最為常見而又被稱為“鱸型目精子”?，F(xiàn)已研究的鱸形目各科魚類精子中，石首魚科魚類(包括本文的黃姑魚和大黃魚)全為II型精子[5]，雀鯛科、慈鯛科和鯛科為I型精子[6]，隆頭魚科中I型和II型精子同時(shí)存在[7]，而馬鲅科精子則是介于I型和II型之間的中間型[8]。

3.1 頭部

黃姑魚和大黃魚精子頭部的形狀均類似橢圓形，細(xì)胞核呈卵圓形或腎形。這與鮸魚[9]、大黃魚[10]等大多數(shù)石首魚科魚類的精子頭部非常相似。在體外受精的硬骨魚中，精子的形狀有所不同。如頭石脂鯉(Bryconcephalus)[11]精子頭部為規(guī)則的圓形。鮭鱒魚(Salmogairdneri)和亞東鮭(Salmotruttafario)精子頭部為卵圓形[12]。另外，中華鱘(Acipensersinensis)、西伯利亞鱘(Acipenser,baeriiBrandt)、小體鱘(Acipenser,ruthenusLinnaeus)和白鱘(Scaphirhynchusalbus)[13]中均發(fā)現(xiàn)了圓柱形的頭部。

硬骨魚類精子的植入窩多為細(xì)胞核表面一個(gè)凹陷，深淺不一。植入窩(implantation fossa)多位于核的后端，也有位于核的一側(cè)[14]。本文中黃姑魚和大黃魚精子的植入窩位于細(xì)胞核表面，為一條淺溝狀結(jié)構(gòu)，其走向與細(xì)胞核長(zhǎng)軸接近于平行，這與尤永隆等[10]描述的大黃魚精子的植入窩一致，與鮸魚、銀鯧精子的植入窩也非常類似[9]，而與鯉魚、黃顙魚精子的植入窩則不同[15]，鯉魚精子的植入窩位于細(xì)胞核一側(cè)，而黃顙魚精子的植入窩位于核后端。

一般硬骨魚類中，近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒的排列表現(xiàn)為兩種形態(tài)。一種是近端中心粒與精子長(zhǎng)軸垂直，呈現(xiàn)為“T”型；另一種是遠(yuǎn)端中心粒與精子長(zhǎng)軸平行，呈現(xiàn)為“L”型[16]。在已研究過的鱸形目魚類精子中，近端中心粒與遠(yuǎn)端中心粒大多相互垂直，呈“T”型排列，如藍(lán)頭錦魚(Thalassomabifasciatum)、黃鰭鯛(Acanthopagrusberda)、澳洲黑鯛(Acanthopagrusaustralis)、菱體兔牙鯛(Lagodonrhomboids)、羊頭鯛(Archosargusprobatocephus)、黑槍魚(blackmarlin)[17]以及本文中的黃姑魚和大黃魚，但也有少數(shù)種類是非垂直排列，如斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)精子的近端中心粒與遠(yuǎn)端中心粒呈120°夾角[18]；大菱鲆(Lachnolaimusmaximus)精子的近、遠(yuǎn)端中心?；コ?35°[17]。

3.2 中段

在石首魚科魚類中，精子中段線粒體通常呈圓形，數(shù)量一般不超過10個(gè)[5,9,10]；而鱸形目的鯛科(Sparidae)和馬鲅科(Polynemidae)魚類的精子則只有一個(gè)線粒體[6,8]。本研究觀察到黃姑魚和大黃魚精子中線粒體的數(shù)量均為4～5個(gè)，程順等[19]在大黃魚精子中觀察到了5個(gè)線粒體，而尤永隆等[10]研究發(fā)現(xiàn)大黃魚精子中段內(nèi)有6個(gè)線粒體，大黃魚線粒體個(gè)數(shù)不一致可能與個(gè)體差異或切片角度不同有關(guān)。

3.3 尾部

包括黃姑魚和大黃魚在內(nèi)，石首魚科魚類的精子均為單鞭毛，軸絲為“9+2”結(jié)構(gòu)[5,9,10]。到目前為止，除大西洋鰻(Anguillaanguilla)和康吉鰻(Congeranguilla)精子的軸絲缺少一對(duì)中央微管，為“9+0”結(jié)構(gòu)外，其它絕大多數(shù)魚類精子的軸絲都為“9+2”結(jié)構(gòu)。某些鲇形目魚類精子具有雙鞭毛，如棘甲鯰科的(Doradidae)韋氏上棘鮠(Anadorasweddellii)和鈍囊鯰屬(Amblydoras)[20]；鱸形目的慈鯛科(Satanopercajurupari)魚類精子也具有雙鞭毛[6]，而天竺鯛科(Apogonidaeimberbis)魚類精子則包含單鞭毛和雙鞭毛兩種類型[21]。

許多硬骨魚類精子鞭毛軸絲的外面都能看到由細(xì)胞質(zhì)向兩側(cè)擴(kuò)張而成的側(cè)鰭[14]，石首魚科中，鞭毛膜上都存在不規(guī)則的側(cè)鰭[5,9,10]，本研究發(fā)現(xiàn)黃姑魚和大黃魚精子鞭毛上也存在不規(guī)則的側(cè)鰭。Mattei等[22]認(rèn)為鞭毛膜的擴(kuò)張對(duì)于提高精子的活動(dòng)能力是一種有效的補(bǔ)充。Stoss等[23]均認(rèn)為側(cè)鰭結(jié)構(gòu)與精子的運(yùn)動(dòng)相適應(yīng)，可提高精子的游動(dòng)速度，有助于魚類受精；而Afzelius等[24]則認(rèn)為側(cè)鰭與精子游泳速率的提高無(wú)多大關(guān)系。關(guān)于精子側(cè)鰭的具體作用還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。另外，尤永隆等[10]在大黃魚精子尾部超微結(jié)構(gòu)中觀察發(fā)現(xiàn)，鞭毛主段的末端呈現(xiàn)膨大的瓶狀，其中存在由微管螺旋而成的簍狀結(jié)構(gòu)。而本研究并未發(fā)現(xiàn)大黃魚精子尾部主段末端有類似膨大的簍狀結(jié)構(gòu)，程順等[19]在大黃魚精子的超微結(jié)構(gòu)研究中也未提及該結(jié)構(gòu)。

3.4 黃姑魚和大黃魚精子比較

黃姑魚和大黃魚精子無(wú)論在形態(tài)、大小還是超微結(jié)構(gòu)上都十分相似，這也是黃姑魚精子可以激活大黃魚卵的原因之一，但由于二者的遺傳物質(zhì)可能存在不相容性，不能獲得存活的大黃魚♀×黃姑魚♂雜交子代。包括黃姑魚和大黃魚在內(nèi)，現(xiàn)已研究的石首魚科魚類的精子在超微結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高度的相似性。Sasaki等[25]根據(jù)對(duì)石首魚科魚類的形態(tài)學(xué)、骨骼學(xué)和肌肉學(xué)特性分析，認(rèn)為該科是單系統(tǒng)起源的。石首魚科中魚類精子的高度相似性支持了這一觀點(diǎn)，同時(shí)也支持了“同科中不同種精子的細(xì)胞器分布一致”這個(gè)假說(shuō)[26]。

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