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蟲螨腈對斑馬魚的急性毒性及生物富集性

2014-03-22 08:31張瑞明李祥英陳崇波張寶蘭張晶張宏濤孫國萍
生態(tài)毒理學(xué)報 2014年3期
關(guān)鍵詞:蟲螨腈斑馬魚農(nóng)藥

張瑞明,李祥英,陳崇波,張寶蘭,張晶,張宏濤,*,孫國萍,2

1. 佛山市環(huán)境健康與安全評價研究中心,佛山 528000 2. 廣東省微生物研究所,廣州 510070

隨著用量的不斷增加,農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的破壞也日漸嚴(yán)重。農(nóng)藥污染問題已成為全世界廣泛關(guān)注的重大環(huán)境問題。為預(yù)防農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響,有必要對農(nóng)藥的環(huán)境安全性和生態(tài)風(fēng)險加以評價。農(nóng)藥環(huán)境安全性評價對促進(jìn)農(nóng)藥合理使用、保障生態(tài)環(huán)境安全具有重要作用[1]。

生物個體或處于同一營養(yǎng)級的許多生物種群,從周圍環(huán)境中吸收并積累某種元素或難分解的化合物,導(dǎo)致生物體內(nèi)該物質(zhì)的平衡濃度超過環(huán)境中濃度的現(xiàn)象,叫生物富集,又叫生物濃縮。這是某些處于食物鏈高位營養(yǎng)級的動物受農(nóng)藥污染與危害的原因之一,施用于農(nóng)田中的農(nóng)藥通過各種途徑進(jìn)入水環(huán)境中, 經(jīng)食物鏈逐級濃縮而對水生生態(tài)系統(tǒng)造成危害, 甚至最終危害到人類健康。農(nóng)藥對水生生物的急性毒性和生物富集性與農(nóng)藥的合理施用密切相關(guān),是農(nóng)藥環(huán)境安全評價的重要參數(shù)[2]。

蟲螨腈(chlorfenapyr),學(xué)名為4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧甲基-5-三氟甲基吡咯-3-腈,又名除盡、溴蟲腈,是一種新型取代芳基吡咯類殺蟲、殺螨劑[3]。具有胃毒及觸殺作用,主要通過作用于昆蟲體內(nèi)多功能氧化酶(MFO)來抑制線粒體ADP 向ATP 轉(zhuǎn)化,由于其作用機(jī)理新穎,殺蟲譜廣、對常規(guī)農(nóng)藥無交互抗性,近年來廣泛應(yīng)用于防止水稻、棉花、蔬菜、柑桔、葡萄、大豆等作物的多種害蟲和害螨[4]。目前國內(nèi)關(guān)于蟲螨腈的研究主要集中在其檢測技術(shù)和殘留動態(tài)方面[3, 5-22],其對環(huán)境中水生生物安全性的相關(guān)報道較少,僅有研究表明溴蟲腈對水生生物和鳥類有一定程度的影響[11]。本研究測定了蟲螨腈對斑馬魚(Brachydaniorerio)的急性毒性和生物富集系數(shù),以期為評價蟲螨腈對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材 料

1.1.1 供試藥劑

95%蟲螨腈原藥由衡水北方農(nóng)藥化工有限公司提供。

99.0%蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)樣品購買于廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2 試驗(yàn)生物

品系:斑馬魚(Brachydaniorerio)。

規(guī)格:從試驗(yàn)魚中隨機(jī)抽取10尾,試驗(yàn)魚的全長為21.94 mm~29.59 mm,體重為0.143 g~0.395 g。

來源:廣州楊氏水族館。

馴養(yǎng):取足夠數(shù)量的試驗(yàn)魚于試驗(yàn)相同條件下馴養(yǎng)至少7 d,自然死亡率應(yīng)小于5%,試驗(yàn)前1 d 停止喂食,急性毒性測定試驗(yàn)期間不喂食。

1.1.3 試驗(yàn)用水

使用過濾曝氣自來水,水的總硬度為103.41 mg·L-1(以CaCO3計),pH為7.63。

1.1.4 試驗(yàn)條件

溫度:23 ℃±2 ℃

溶解氧:不低于空氣飽和值的60%

微弱光照:14 h·d-1

1.1.5 儀器設(shè)備和試劑

儀器:氣相色譜儀,帶電子捕獲檢測器( Agilent 7890,美國Agilent公司,美國),分析天平(ABS 220-4型,德國KERN,德國),溫濕度計(DSR-THEXT 型,佐格微系統(tǒng)(杭州)有限公司,杭州,中國),pH計(PH3110 型,德國WTW,德國),氮吹儀(MTN-2800D,天津奧特賽恩斯儀器有限公司,天津,中國),溶解氧測定儀(Oxi3205,德國WTW,德國),旋渦混合儀(QT-1,上海琪特分析儀器有限公司,上海,中國) ,冷凍離心機(jī)(GL-21M型,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,湖南,中國) ,超純水儀(Millipore Aquelix5 型,密理博(上海)貿(mào)易有限公司,臺灣,中國)。

設(shè)備:2.5 mL無菌注射器( 湖南平安醫(yī)械科技有限公司),0.22 μm針孔式有機(jī)濾膜,魚缸、燒杯、量筒、容量瓶、吸管等。

試劑:乙腈(≥99.9%,上海安譜科學(xué)儀器有限公司),丙酮(100%,廣州試劑廠),二氯甲烷(100%,廣州試劑廠),吐溫-80(相對密度1.06-1.10,天津大茂化學(xué)試劑廠),OP-10(≥99.0%,天津大茂化學(xué)試劑廠),重鉻酸鉀(≥99.8%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),氯化鈉(≥99.8%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),無水硫酸鈉(≥99.0%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,使用前650 ℃烘烤4 h以上)。

1.2 方 法

1.2.1 魚類急性毒性試驗(yàn)

參照OECD 化學(xué)品測試導(dǎo)則[23]和我國《化學(xué)品測試方法》[24]進(jìn)行。

1.2.1.1 魚類敏感性檢查:采用重鉻酸鉀作為參比物進(jìn)行魚類敏感性檢查。重鉻酸鉀經(jīng)105 ℃烘后,準(zhǔn)確稱取5.000 g到小燒杯中,用適量的試驗(yàn)用水溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶中,用試驗(yàn)用水稀釋到標(biāo)線,混勻,配制成10 g·L-1的參比物貯備液。試驗(yàn)體系的總體積為3 L,根據(jù)所設(shè)濃度,計算出參比物貯備液和試驗(yàn)用水的比例,加入至試驗(yàn)容器中分別配制成150 mg·L-1、192 mg·L-1、246 mg·L-1、315 mg·L-1和403 mg·L-15 個濃度梯度,每個濃度設(shè)置1 個平行,同時設(shè)1個空白對照組。各試驗(yàn)容器中放入10 尾魚,試驗(yàn)暴露周期為24 h。試驗(yàn)結(jié)束時,觀察記錄受試魚死亡數(shù)。試驗(yàn)溫度為(23±2) ℃,光暗周期為12 h∶12 h,試驗(yàn)期間不喂食。

1.2.1.2 預(yù)試驗(yàn):先對95%蟲螨腈原藥進(jìn)行較大范圍濃度系列(0.002、0.005、0.01、0.02 mg·L-1)的預(yù)試驗(yàn),每組用魚5尾,不設(shè)平行;試驗(yàn)采用靜態(tài)方式進(jìn)行,試驗(yàn)期間不換水,觀察并記錄試驗(yàn)用魚96 h(或48 h)的中毒癥狀和死亡情況。試驗(yàn)溫度為(23±2) ℃,光暗周期為12 h∶12 h,試驗(yàn)期間不喂食。由此求出死亡率100%的最低濃度和死亡率為0%的最高濃度的范圍,并在該范圍內(nèi)設(shè)置正式試驗(yàn)的濃度。

1.2.1.3 正式試驗(yàn):根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置正式試驗(yàn)的濃度梯度,即0.0055 mg·L-1、0.0074 mg·L-1、0.010 mg·L-1、0.014 mg·L-1和0.018 mg·L-15 個濃度梯度。各試驗(yàn)容器中放入10 尾魚,試驗(yàn)暴露周期為96 h,試驗(yàn)采用半靜態(tài)方式進(jìn)行,每隔24 h更換1 次試驗(yàn)溶液,并觀察記錄受試魚死亡數(shù)。試驗(yàn)溫度為( 23 ± 2) ℃,光暗周期為12 h∶ 12 h,試驗(yàn)期間不喂食。計算蟲螨腈對斑馬魚的24 h、48 h、72 h 和96 h-LC50。

1.2.1.4 檢測指標(biāo):試驗(yàn)期間,于試驗(yàn)開始后24 h、48 h、72 h和96 h觀察記錄各容器內(nèi)魚的活動狀態(tài)和死魚數(shù),用玻璃棒輕觸魚的尾部,無可見運(yùn)動即為死亡,并及時取出死魚。測定各組試驗(yàn)開始后0 h、96 h以及24 h、48 h、72 h更換試驗(yàn)溶液前后的pH、溫度和溶解氧含量。

1.2.1.5 數(shù)據(jù)處理:采用DPS13.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計算96 h的LC50值以及95%的置信限。

1.2.2 生物富集試驗(yàn)

采用半靜態(tài)法,根據(jù)95%蟲螨腈原藥對斑馬魚96 h 致死中濃度測定結(jié)果,以96 h LC50的1/100、1/10 濃度設(shè)置2 個供試藥液濃度處理,即2.0×10-4mg·L-1和2.0×10-3mg·L-1,每個濃度設(shè)置2個平行。同時設(shè)置1個不加農(nóng)藥的空白對照組和1個溶劑對照組,每組設(shè)置2個平行。

生物富集作用于(23±2)℃條件下進(jìn)行,魚缸內(nèi)加入10 L試驗(yàn)藥液,投放斑馬魚25尾,滿足每天每升水承載魚重(濕重)0.1 g~1.0 g;試驗(yàn)過程中于0 h、24 h、48 h、96 h、144 h和192 h測定水中和魚體內(nèi)富集受試物濃度,取樣均在更換受試物試驗(yàn)溶液前進(jìn)行,每次取樣時試驗(yàn)溶液均需攪拌均勻,試驗(yàn)魚隨機(jī)選取4尾;同時在換液前后分別測定試驗(yàn)溶液pH、溫度和溶解氧含量,記錄試驗(yàn)魚狀態(tài)。試驗(yàn)期間每24 h投放餌料1次,每次約0.2 g。試驗(yàn)結(jié)束時,試液中農(nóng)藥含量不低于初始濃度的80%。試驗(yàn)期間水中溶解氧不得低于5 mg·L-1。

按下式計算生物富集系數(shù)(BCF)[ 25]:

BCF=Cfs/Cws

式中,Cws為水溶液中農(nóng)藥的濃度(mg·L-1),Cfs為魚體內(nèi)的農(nóng)藥濃度(mg·kg-1)。

采用Microsoft Office Excel 2007對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。

1.2.3 色譜條件

儀器:Agilent7890A氣相色譜儀;色譜柱:HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm);柱溫:230 ℃;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;檢測器:ECD;檢測器溫度:300 ℃;氣流模式:恒壓 14.5 psi;載氣:氮?dú)?,純度大于等?9.999%;分流方式:分流;分流比:15:1;進(jìn)樣量:5 μL。

1.2.4 樣品前處理方法

1.2.4.1 水樣前處理:取200 mL水樣于500 mL分液漏斗中,加入約5 g的氯化鈉,再加入80 mL二氯甲烷,充分震蕩,靜置;溶液分層后,將二氯甲烷相轉(zhuǎn)移至三角瓶中,加入10 g的無水硫酸鈉,靜置1 h;取40 mL二氯甲烷旋蒸至干,用1.0 mL丙酮定容,過0.22 μm濾膜,待測。

1.2.4.2 魚樣前處理:取斑馬魚4尾,稱重并記錄,放入研缽中,加入5 g的無水硫酸鈉,將魚研碎后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,用15 mL乙腈分3次清洗研缽,轉(zhuǎn)移至離心管中,超聲10 min,在7 000 r·min-1下離心5 min,收集離心上清液,重復(fù)超聲、離心操作2次,將3次收集到的上清液混合倒入50 mL容量瓶中,用乙腈定容。在容量瓶中取2.0 mL上清液氮吹,吹干后用1.0 mL丙酮定容,過0.22 μm濾膜,待測。

1.2.5 添加回收率測定

1.2.5.1 水樣加標(biāo)試驗(yàn):量取200 mL水樣后,精確添加蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平分別為2.0×10-3、2.0×10-4和2.0×10-5mg·L-1),振搖均勻,于室溫下放置10 min,其他步驟按照1.2.4.1方法進(jìn)行提取,按照1.2.3色譜條件進(jìn)行檢測。每個添加水平重復(fù)3次。

1.2.5.2 魚樣加標(biāo)試驗(yàn):稱取魚樣后,精確添加蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加水平分別為5和0.05 mg·kg-1),振搖均勻,于室溫下放置10 min,其他步驟按照1.2.4.1方法進(jìn)行提取,按照1.2.3色譜條件進(jìn)行檢測。每個添加水平重復(fù)5次。

2 結(jié)果( Results)

2.1 重鉻酸鉀對斑馬魚的急性毒性

重鉻酸鉀對斑馬魚急性毒性結(jié)果見表1,重鉻酸鉀對斑馬魚的24 h-LC50值為316 mg·L-1,滿足參比物重鉻酸鉀24 h-LC50值在200 mg·L-1~400 mg·L-1之間的試驗(yàn)有效性要求[16]。參比物重鉻酸鉀試驗(yàn)結(jié)果證明斑馬魚的敏感性,同時驗(yàn)證了檢測過程的有效性。

2.2 95%蟲螨腈原藥對斑馬魚的急性毒性

試驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,95%蟲螨腈原藥對斑馬魚96h-LC50為0.015 mg·L-1,其95%的置信限為0.011 mg·L-1~0.12 mg·L-1。《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則》[26]規(guī)定的化學(xué)農(nóng)藥對魚類急性毒性的評價標(biāo)準(zhǔn):LC50>10 mg·L-1,低毒;1.0 mg·L-1

試驗(yàn)期間,試驗(yàn)溶液中pH變化范圍為7.60~8.14;溫度變化范圍為21.1 ℃~22.5 ℃;溶解氧含量的變化范圍為74~93%。試驗(yàn)結(jié)束時,空白對照組和溶劑對照組魚死亡率均為0%,低于10%。

表1 重鉻酸鉀對斑馬魚的急性毒性Table 1 Acute toxicity of potassium dichromate against B. rerio

表2 蟲螨腈對斑馬魚的急性毒性Table 1 Acute toxicity of chlorfenapyr against B. rerio

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取31.12 mg蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中,用乙腈將其溶解,配成濃度為1.18×103mg·L-1的貯備液。用丙酮將貯備液逐級配成有效濃度為0.2 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.02 mg·L-1、0.005 mg·L-1、0.002 mg·L-1和0.001 mg·L-1一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在氣相色譜檢測條件下測定,以質(zhì)量濃度(x, mg·L-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1。由所測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,其線性方程是y=102623x+78.167,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。蟲螨腈濃度在0.001~0.2 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性相關(guān)性。

2.4 方法的回收率和精密度

在空白的水樣和魚樣中,添加已知含量的蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)品,按照上述前處理方法和色譜操作條件測定其含量,計算其回收率及變異系數(shù),結(jié)果見表4和表5。

由表3和表4可知,通過對蟲螨腈殘留樣品分析的準(zhǔn)確度及精確度檢驗(yàn),本方法測定的魚樣中蟲螨腈的回收率為92.0%~108.2%,變異系數(shù)為4.4%~6.5%,水中蟲螨腈的回收率為75.1%~100.2%,變異系數(shù)為3.1%~6.6%。因此,利用本方法進(jìn)行蟲螨腈殘留樣品的分離和含量測定,靈敏度高,重現(xiàn)性好,能為樣品檢測提供可靠的數(shù)據(jù)。本方法對水樣和魚樣中蟲螨腈的檢出限分別為5.0×10-6mg·L-1和1.0×10-3mg·kg-1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve

蟲螨腈在水和魚體中殘留量的典型色譜圖見圖2和圖3。

表3 蟲螨腈水中添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Fortified recovery and RSD of chlorfenapyr in water(n=3)

表4 蟲螨腈水中添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 4 Fortified recovery and RSD of chlorfenapyr in water(n=3)

圖2 蟲螨腈在水中殘留量的典型色譜圖Fig. 2 GC chromatography of chlorfenapyr in water

圖3 蟲螨腈在魚中殘留量的典型色譜圖Fig. 3 GC chromatography of chlorfenapyr in fish

2.5 斑馬魚對95%蟲螨腈原藥的生物富集性

試驗(yàn)結(jié)果見表5至表6。結(jié)果表明,試驗(yàn)結(jié)束時,兩個試驗(yàn)組水中蟲螨腈的含量分別為初始含量的94.5%和90.5%,均高于80%,符合“評價準(zhǔn)則”要求。在兩個處理濃度下,斑馬魚對蟲螨腈的生物富集系數(shù)(BCF8d)分別為1 211.6和1 549.7。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則》的評價標(biāo)準(zhǔn),在本試驗(yàn)條件下,95%蟲螨腈原藥對斑馬魚的生物富集性為高富集性。試驗(yàn)過程中未有斑馬魚死亡,空白對照組和溶劑對照組水中和斑馬魚中未檢出蟲螨腈。

試驗(yàn)期間,試驗(yàn)溶液中pH變化范圍為7.321~8.125;溫度變化范圍為22.7 ℃~24.0 ℃;溶解氧含量的變化范圍為5.2 mg·L-1~7.9 mg·L-1。

3 討論(Discussion )

進(jìn)行農(nóng)藥對魚類的毒性試驗(yàn)時, 應(yīng)盡可能避免溶劑和助劑本身對魚類的影響[27]。試驗(yàn)采用丙酮對蟲螨腈進(jìn)行助溶,加入量為0.1%(V/V)。結(jié)果表明,魚類急性毒性試驗(yàn)和生物富集性試驗(yàn)中溶劑對照組均未有出現(xiàn)斑馬魚死亡情況,因此可以認(rèn)為本試驗(yàn)中丙酮對斑馬魚毒性試驗(yàn)的影響可以忽略。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,蟲螨腈對斑馬魚屬于高毒、高富集性農(nóng)藥。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,要特別注意蟲螨腈的使用范圍、施用量和使用方法,應(yīng)避免在水田中使用此類農(nóng)藥,以免對生態(tài)環(huán)境造成危害。另外,農(nóng)藥在環(huán)境中的降解和移動, 決定了農(nóng)藥在水、氣、土壤中的殘留和污染狀況, 也是評價農(nóng)藥對各種環(huán)境生物影響的重要參數(shù)。因此,有必要開展蟲螨腈其他環(huán)境行為特性如土壤降解、水解、光解等的研究,以期全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確地評價蟲螨腈對水生生物的生態(tài)風(fēng)險。

表5 蟲螨腈生物富集試驗(yàn)測定結(jié)果Table 5 Results of bio-concentration tests of chlorfenapyr

注:1)試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2設(shè)定濃度分別為2.0×10-4mg·L-1和2.0×10-3mg·L-1; 2)表中數(shù)據(jù)均為兩次重復(fù)平均值。

表6 蟲螨腈生物富集系數(shù)(BCF8d)Table 6 BCF8d of chlorfenapyr

致謝:感謝實(shí)驗(yàn)室全體成員的參與和支持。感謝衡水北方農(nóng)藥化工有限公司提供測試樣品。

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