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(1.安徽師范大學環(huán)境科學與工程學院,安徽蕪湖 241003;2.安徽農(nóng)業(yè)大學教育部農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學與生物技術(shù)重點實驗室,安徽合肥 230036)

茶籽油的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的餅粕,其中含有皂素、蛋白質(zhì)、多糖等可利用的成分[1]。茶皂素作為其中的一種重要成分,具有優(yōu)良的表面活性[2],廣泛應(yīng)用于化學工業(yè)、日用化工、養(yǎng)殖業(yè)等[3-5]。然而目前廣泛使用的主要是粗品茶皂素,其純度較低,含有大量雜質(zhì),若使用膜分離、大孔樹脂吸附、泡沫分離等方法進行純化可以有效提高茶皂素純度[1,6],但由于其中一些結(jié)構(gòu)相似的黃酮類、多酚類雜質(zhì),即使高純度茶皂素的水溶液顏色仍然較深,極大限制了茶皂素制品的使用范圍。因此,茶皂素的脫色越來越引起學者的關(guān)注與研究。

目前,茶皂素的脫色主要有樹脂層析法、氧化脫色法,這些方法都存在一定的缺陷。例如樹脂層析法生產(chǎn)時間長,成本較高;而氧化脫色則使用雙氧水、高氯酸等強氧化劑,在脫色時需要較為劇烈的反應(yīng)條件,會對茶皂素的表面活性產(chǎn)生一定影響。其原因主要是強氧化劑對油茶皂苷的結(jié)構(gòu)造成破壞,造成糖苷鍵斷裂,從而影響產(chǎn)品的性能。為解決這一問題,本實驗采用還原脫色方法對茶皂素溶液進行脫色實驗,結(jié)果取得了很好的脫色效果。還原脫色法具有廣泛的應(yīng)用前景,為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶皂素(90%純度) 浙江東方茶業(yè)科技有限公司;香草醛、濃硫酸、硼氫化鉀、亞硫酸氫鈉等試劑 無錫展望化學試劑公司,均為分析純;乙腈、乙酸 TEDIA公司,均為色譜純。

Finnigan LCQ Advantage Max ion trap MS 美國Finnigan公司;BUCHI Mini Spray Dryer B-290噴霧干燥機 步琪實驗設(shè)備貿(mào)易(上海)有限公司;CM-3500d色差計 日本Konica公司。

1.2 實驗方法

因脫色實驗中溶液的顏色都是向著越來越淺的方向變化,因此可以通過考察ΔE值的大小來比較脫色效果的好壞。實驗測定前均使用標準白度板和黑度板進行校準,以提高數(shù)據(jù)的準確性。

1.2.1 單因素實驗 茶皂素溶液的濃度會顯著影響脫色時脫色劑的使用量以及最終的脫色效果,因此實驗均配制濃度為10%(w/v)的茶皂素水溶液。使用25℃恒溫水浴維持反應(yīng)溫度,首先考察脫色劑的使用量對脫色效果的影響,確定亞硫酸氫鈉的添加量為2.0%(與茶皂素的質(zhì)量比,下同),通過改變硼氫化鉀的加入量考察其對ΔE值的影響。隨后均向溶液中加入1.0%硼氰化鉀,考察不同亞硫酸氫鈉加入量對脫色效果的影響。之后分別加入1.0%的硼氰化鉀以及2.0%亞硫酸氫鈉,調(diào)整反應(yīng)溫度考察溫度的影響。最后其它條件不變,調(diào)整溶液pH,考察pH對脫色效果的影響。每組實驗測定3次,具體實驗參數(shù)見表1。

表1 單因素實驗參數(shù)表Table 1 Single factor experimental design

1.2.2 二次響應(yīng)面優(yōu)化 將單因素確定的四個參數(shù)使用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化。響應(yīng)面優(yōu)化實驗編碼見表2,所有實驗數(shù)據(jù)均進行3次平行實驗,所得數(shù)據(jù)使用SAS 9.1.3軟件進行分析。

1.2.3 檢測 脫色后的樣品使用步琪B-290噴霧干燥器干燥,將獲得的樣品進行檢測。噴霧干燥器進口溫度140℃,出口溫度90℃,泵速10%。

1.2.3.1 濃硫酸香草醛顯色法 濃硫酸香草醛顯色法參照文獻[11]進行測定。

1.2.3.2 LC-MS/MS檢測 使用Finnigan LCQ Advantage Max ion trap MS檢測油茶皂苷,液相分離使用Agilent,TC-C18,25μm,250mm×4.6mm色譜柱。流動相A為0.1%乙酸-水,流動相B為0.1%乙酸-乙腈。使用梯度洗脫,流動相B在25min時間內(nèi)從20%提高到80%,流速1.0mL/min,進樣體積為10μL[12]。毛細管質(zhì)譜儀使用陰離子檢測方式(SIM)對樣品進行檢測。離子化噴霧器電壓為4.5kV,毛細管和飄移管電壓分別為-40V和-130V,毛細管溫度為350℃[13]。

表2 響應(yīng)面水平設(shè)計表Table 2 Coding of levels of the elements in these experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

單因素實驗結(jié)果見圖1,從圖中可以看出隨著兩種脫色劑加入量的逐漸增大,ΔE值有很大的提高,脫色效果非常明顯,但表現(xiàn)出來的趨勢卻有明顯差別。其中隨著KBH4加入量的逐漸增大,ΔE值呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當KBH4的加入量為1.0%(w/w)時,脫色效果最佳,ΔE值為29.701±0.297。

另一種脫色劑NaHSO3對ΔE值的影響趨勢則與KBH4有明顯的不同,首先迅速增大,之后增速趨緩,而ΔE值增長幅度趨勢的轉(zhuǎn)變點的加入量為2.0%(w/w)?？紤]到實際操作過程中成本的要求,因此后續(xù)實驗均2.0%(w/w)NaHSO3添加量進行優(yōu)化。

此外,從圖中另外兩條曲線的走勢可以看出,pH和溫度對于脫色效果的影響不大。隨著pH的增大,脫色效果有小幅下降,而反應(yīng)溫度的升高則對脫色效果有小幅的提升,但這兩個因素的影響都遠不及兩種脫色劑的使用效果。

圖1 脫色單因素實驗 Fig.1 Effects of single factors on decolorization

表4 方差分析表Table 4 ANOVA analysis for the response surface modified

2.2 二次響應(yīng)面優(yōu)化

使用SAS 9.1.3分析軟件對茶皂素還原脫色進行4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計與分析。共設(shè)計31組實驗,其中7組為中心點重復實驗,脫色結(jié)果見表3。軟件對數(shù)據(jù)進行多元擬合,得到兩種還原脫色劑脫色效果的回歸方程如下:

ΔE=29.021+3.578X1+2.439X2-0.146X3+0.330X4-2.67X12+0.583X1X2-0.117X1X3-0.119X1X4-2.17X22-0.068X2X3+0.131X2X4-0.676X32+0.018X3X4-1.712X42

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及色差測定結(jié)果Table 3 Response surface design matrix and result of ΔE

續(xù)表

表4為該模型的方差分析表,從表中可以看出模型顯著性很高(p=0.0001),失擬項在α=0.01水平上不顯著(p=0.1427>0.0633)。模型的決定系數(shù)R2為0.9981,校正決定系數(shù)為0.9777,說明該模型具有很好的擬合程度,對于整個脫色效果的擬合優(yōu)化是非常合適的。脫色實驗中KBH4與NaHSO3的添加量對脫色的效果影響為極顯著(均為p=0.0001),而溫度與pH則影響不大;在交互項中,僅有KBH4與NaHSO3的添加量之間有顯著的影響(p=0.009198)。這說明,在整個脫色過程中起主要作用的是兩種脫色劑的加入量以及加入比例。實驗表明兩種脫色劑的加入比例約為1∶2的時候能獲得更好的脫色效果。兩種脫色劑必須以一定比例進行反應(yīng),才能更好地生成中間產(chǎn)物,從而進行脫色作用,這與Gerrie的研究結(jié)果類似[14]。

圖2 KBH4與NaHSO3交互作用響應(yīng)面圖 Fig.2 Response surfaces for ΔE as a function of KBH4 and NaHSO3

兩種脫色劑中,KBH4可以電離出H-,而NaHSO3則可以電離出H+離子,這兩種離子均會對溶液的pH產(chǎn)生影響,當然pH也會很大程度地影響這兩種物質(zhì)的電離以及反應(yīng)。但從表4的數(shù)據(jù)可以看出,pH對脫色效果的影響不大,這主要是由于兩種脫色劑進行脫色的時候并不是直接與色素反應(yīng),而是首先生成中間產(chǎn)物,通過具有高活性的中間產(chǎn)物與色素中的發(fā)色基團反應(yīng),達到脫色的效果[15],而這種中間產(chǎn)物對于溶液的pH并不敏感,因此表現(xiàn)在數(shù)據(jù)上為pH與兩種脫色劑的交互作用不顯著(X1X3:p=0.56108;X2X3:p=0.733004)。

2.3 驗證實驗

利用SAS軟件進行分析和擬合的最終優(yōu)化條件為X1=0.720,X2=0.664,X3=-0.203,X4=0.096,即KBH4、NaHSO3的添加量分別為1.180%(w/w)和2.164%(w/w),pH在4.797,脫色溫度為50.96℃,此時ΔE值為31.150±0.304。

為驗證模型預(yù)測的準確性,在KBH4、NaHSO3的添加量分別為1.2%(w/w)和2.2%(w/w),pH為4.8,脫色溫度為51.0℃條件下進行3次實驗,此時ΔE值為31.324±0.378,表明使用響應(yīng)面法模擬的優(yōu)化結(jié)果具有很高的可靠性和準確性。

2.4 檢測

將茶皂素脫色溶液噴霧干燥得到粉末。與未脫色樣品相比,脫色后的茶皂素顏色有了很大的改觀,顏色由原先的土黃色變成乳白色。

2.4.1 濃硫酸香草醛檢測 使用濃硫酸香草醛比色法進行檢測,結(jié)果表明脫色后樣品純度為91.6%,與脫色前的91.8%相比沒有明顯變化。同時脫色后油茶皂苷的得率很高,為95.8%,具有很好的應(yīng)用前景。

2.4.2 LC-MS/MS檢測 鑒于氧化脫色法會對油茶皂苷的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響,使用LC-MS/MS進行檢測,考察還原脫色法是否同樣會對油茶皂苷的結(jié)構(gòu)造成破壞,結(jié)果見圖3。圖3中a為液相圖,b為質(zhì)譜離子流圖,c為陰離子流圖,d為m/z為1201的目標成分離子流圖,e為目標成分的二級質(zhì)譜圖。從a、b、c、d圖中可以看出,液相保留時間為15.97min時質(zhì)譜圖上出現(xiàn)m/z為1201的目標成分峰,而e圖的二級質(zhì)譜圖上則顯示m/z為1021、889兩個峰,分別為失去一個己糖基和一個戊糖基的皂苷結(jié)構(gòu)。結(jié)合以上幾張圖譜可以判斷,保留時間為15.94min的成分為油茶皂苷B2[16],說明經(jīng)過脫色以后,油茶皂苷的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。

圖3 脫色后油茶皂苷LC-MS/MS檢測 Fig.3 LC-MS/MS chromatogram of sasanquasaponin after blanching

3 結(jié)論

本實驗通過使用還原劑的方法對茶皂素進行脫色取得了很好的脫色效果。通過響應(yīng)面優(yōu)化得出最優(yōu)條件為:KBH4、NaHSO3的添加量分別為1.2%(w/w)和2.2%(w/w),pH在4.8,脫色溫度為51.0℃,此時ΔE值為31.324±0.378。脫色后的茶皂素純度為91.6%,得率為95.8%。通過LC-MS/MS進行檢測,結(jié)果表明還原脫色法對油茶皂苷的結(jié)構(gòu)沒有影響,脫色后仍然保持了原有的結(jié)構(gòu)和特性,具有廣泛的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

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