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(1.安徽科技學(xué)院應(yīng)用微生物研究所,安徽鳳陽(yáng) 233100；2.嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073)

樹(shù)舌(Ganodermaapplanatum)是隸屬于靈芝屬的珍稀藥用真菌,其子實(shí)體、菌絲體與發(fā)酵液中含有多種藥用成分,具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗衰老等多種藥用功效,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-3]。

鍺雖非人體必需元素,但鍺的一些化合物具有一定的生理活性和保健效果,尤其是天然有機(jī)鍺化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化與降血脂等多重高度生物活性[4-6]。同時(shí)對(duì)糖尿病、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、慢性胃炎也有一定的治療效果。

目前有關(guān)真菌如樺褐孔菌、蛹擬青霉、羊肚菌等的富鍺研究已有相關(guān)報(bào)道[7-9],而樹(shù)舌富鍺培養(yǎng)的研究報(bào)道較少。本研究擬探討樹(shù)舌將無(wú)機(jī)鍺轉(zhuǎn)化為有機(jī)鍺的能力及微量元素鍺對(duì)樹(shù)舌菌絲體中主要活性成分含量的影響,為開(kāi)發(fā)富鍺樹(shù)舌功能性食品或藥品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹(shù)舌(G.applanatum) 安徽科技學(xué)院應(yīng)用微生物研究所保藏；腺苷 購(gòu)自Sigma公司;氧化鍺、磷酸氫二鉀、葡萄糖、蛋白胨、無(wú)水乙醇、酵母膏、硫酸鎂、濃硫酸、磷酸二氫鉀等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂18g,水1000mL;種子培養(yǎng)基 馬鈴薯250g,葡萄糖30g,蛋白胨5g,水1000mL;液體培養(yǎng)基 葡萄糖30g,蛋白胨5g,酵母粉5g,磷酸二氫鉀3.0g,硫酸鎂1.5g,水1000mL。

T6型紫外可見(jiàn)分光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;QYC211型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA1004電子分析天平 上海精科天平有限公司;5810R型冷凍離心機(jī) Eppendorf;1525型液相色譜儀 Waters;TAS-990原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹(shù)舌液體富鍺培養(yǎng)工藝 將活化的菌絲體接入裝有80mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,置于恒溫振蕩器上28℃培養(yǎng)5d得到搖瓶種子液。按10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富鍺培養(yǎng),培養(yǎng)條件:28℃、160r/min、培養(yǎng)7d。

1.2.2 液體培養(yǎng)物的處理 將培養(yǎng)好的醪液離心,分別收集菌絲體和上清液。上清液按文獻(xiàn)[10]方法提取胞外多糖;菌絲體用去離水反復(fù)沖洗,直至水洗液中檢測(cè)不到鍺為止。菌絲體經(jīng)真空冷凍干燥后稱重,并按文獻(xiàn)[2]方法提取胞內(nèi)多糖。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定 硫酸-苯酚法[11]

1.2.4 腺苷含量測(cè)定 高效液相色譜法[12]。

1.2.5 鍺含量的測(cè)定 利用原子吸收法:分析波長(zhǎng)為265.2nm,光譜通帶寬為0.6nm,燈電流為8mA,進(jìn)樣體積為10μL。鍺標(biāo)準(zhǔn)曲線:按分析條件對(duì)2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL 鍺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣10μL 測(cè)定,并求回歸方程[13]。

1.2.6 有機(jī)鍺含量測(cè)定 參見(jiàn)文獻(xiàn)[14-15]將菌絲體粉碎后經(jīng)透析袋透析,每天換2～3次水,將其中的無(wú)機(jī)鍺透析掉,然后將濃縮的樣品直接置于50mL坩堝內(nèi),于600℃灰化1h以上,冷卻后用30mL體積分?jǐn)?shù)0.5%硝酸少量多次清洗,轉(zhuǎn)移至100mL燒杯中,在磁力攪拌器上邊加熱至60℃以下邊攪拌,使坩堝內(nèi)的灰化物完全溶解,離心分離沉淀,取上清液定容至50mL,待測(cè)定有機(jī)鍺含量。有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式:

有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率(%)=(有機(jī)鍺含量/培養(yǎng)基中總鍺含量)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 鍺對(duì)樹(shù)舌生物量及有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的影響

在液體培養(yǎng)基中添加氧化鍺,設(shè)置8個(gè)不同的濃度,探討樹(shù)舌對(duì)鍺的耐受特性,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,樹(shù)舌具有較強(qiáng)的耐鍺能力,并且在一定的濃度范圍內(nèi)鍺對(duì)樹(shù)舌菌絲體的生長(zhǎng)具有很好的促進(jìn)作用,當(dāng)鍺濃度度為250μg/mL時(shí),菌體生物量最大,達(dá)到15.44g/L,是空白對(duì)照的1.38 倍。但鍺濃度大于250μg/mL時(shí),隨其濃度的增大,生物量呈直線下降。由圖2可知在一定濃度范圍內(nèi)菌絲體中有機(jī)鍺的含量隨著培養(yǎng)基中鍺濃度的增大而增加,且有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率隨之增加,當(dāng)鍺濃度為250μg/mL時(shí),有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率達(dá)最高為2.35%。當(dāng)鍺濃度大于250μg/mL時(shí),菌絲體中有機(jī)鍺含量增加不明顯,且有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率不斷降低。經(jīng)方差分析可知鍺濃度對(duì)菌絲體中有機(jī)鍺含量及有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率有顯著影響。

2.2 鍺對(duì)樹(shù)舌胞外多糖含量的影響

由圖3可知,低濃度的鍺對(duì)樹(shù)舌胞外多糖合成有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)培養(yǎng)基中鍺濃度為150μg/mL時(shí),胞外多糖含量最多,達(dá)到了1.12g/L,是空白對(duì)照的1.37倍。方差分析可知,在鍺濃度為150μg/mL時(shí)與空白對(duì)照相比,對(duì)胞外多糖產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)鍺濃度大于150μg/mL時(shí),胞外多糖含量逐漸降低,并且比空白對(duì)照的胞外多糖含量還要低,說(shuō)明高濃度的鍺對(duì)胞外多糖的合成有抑制作用。

圖1 鍺對(duì)樹(shù)舌生物量的影響 Fig.1 Effect of germanium on the biomass of G. applanatum

圖2 鍺對(duì)樹(shù)舌菌絲體有機(jī)鍺轉(zhuǎn)化率的影響 Fig.2 Effect of germanium on conversion rate of organic germanium in mycelia of G. applanatum

圖3 鍺對(duì)樹(shù)舌胞外多糖含量的影響 Fig.3 Effect of germanium on the content of extracellular polysaccharide of G. applanatum

2.3 鍺對(duì)樹(shù)舌胞內(nèi)多糖含量的影響

從圖4可以看出,低濃度的鍺對(duì)菌絲體胞內(nèi)多糖的生成有明顯促進(jìn)作用,且比對(duì)胞外多糖合成的促進(jìn)作用更強(qiáng)。在培養(yǎng)基中鍺濃度為250μg/mL時(shí),胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高,達(dá)到了24.88mg/g,是對(duì)照組的1.76倍。當(dāng)鍺濃度大于250μg/mL時(shí),胞內(nèi)多糖含量逐漸降低。但在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)依然存在一定的促進(jìn)作用。在鍺濃度為350μg/mL時(shí),胞內(nèi)多糖含量為18.18mg/g,是對(duì)照組的1.28倍。方差分析可知鍺對(duì)胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用。

圖4 鍺對(duì)樹(shù)舌胞內(nèi)多糖含量的影響 Fig.4 Effect of germanium on the content of intracellular polysaccharide of G. applanatum

2.4 鍺對(duì)樹(shù)舌菌絲體腺苷含量的影響

從圖5可以看出,鍺濃度對(duì)菌絲體腺苷含量具有顯著的影響。鍺濃度在250μg/mL時(shí),腺苷含量達(dá)到最高為1.41mg/g,是空白對(duì)照的2倍,小于該濃度時(shí)菌絲體中腺苷含量隨著鍺濃度的增加而不斷增加,當(dāng)鍺濃度高于250μg/mL時(shí)腺苷含量開(kāi)始下降,在鍺濃度350μg/mL時(shí),菌體的腺苷含量還比對(duì)照組高,是對(duì)照組的1.1 倍。

圖5 鍺對(duì)樹(shù)舌菌絲體腺苷含量的影響 Fig.5 Effect of germanium on the content of adenosine from G. applanatum

3 結(jié)論

有機(jī)鍺具有高度的生物活性,可以通過(guò)大型真菌進(jìn)行富集而獲得。本研究結(jié)果表明,培養(yǎng)基中加入適量的鍺對(duì)菌絲體中生物活性物質(zhì)的含量有顯著的提高作用,在鍺濃度為250μg/mL時(shí),生物量、菌絲體中有機(jī)鍺、胞內(nèi)多糖和腺苷含量較對(duì)照組均有顯著提高。該研究結(jié)果與陳宏偉等對(duì)蛹蟲(chóng)草研究較為一致,在一定的鍺濃度范圍內(nèi)對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖和腺苷合成有顯著促進(jìn)作用,最適添加量在200～300μg/mL;當(dāng)鍺濃度過(guò)高時(shí)反而有抑制作用,但是兩者對(duì)有機(jī)鍺的轉(zhuǎn)化率有一定的差別,本實(shí)驗(yàn)中樹(shù)舌有機(jī)鍺最高轉(zhuǎn)化率為2.35%,而蛹蟲(chóng)草達(dá)有3.7%[14]。而胞外多糖的產(chǎn)量在鍺濃度為150μg/mL時(shí)達(dá)到最高,這與陳石良等[16]對(duì)灰樹(shù)花富鍺培養(yǎng)研究有所不同。另外,黃曉冬、李秋蕊等人對(duì)樺褐孔菌、羊肚菌的研究有所不同的是最適添加量較低分

別為40、100μg/mL,說(shuō)明不同菌體對(duì)鍺的耐受力及有機(jī)化能力存在差異。本研究為開(kāi)發(fā)富鍺樹(shù)舌功能性食品或藥品奠定了基礎(chǔ),菌絲體中有效成分含量的提高以及鍺元素的富集可能會(huì)提高產(chǎn)品對(duì)人體的保健功能,實(shí)際效果如何還需進(jìn)一步通過(guò)藥理及毒理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

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