丁毅 張海萍 鐘山 付莉 白冬雨 張海芳

廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建廈門(mén) 361003

非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)及其與臨床病理特征的關(guān)系

丁毅 張海萍 鐘山 付莉 白冬雨 張海芳

廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建廈門(mén) 361003

目的 探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變情況及其與臨床病理的關(guān)系。方法 對(duì)2010年1月—2014年1月來(lái)該院診治的159份非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)中采用基因測(cè)序方法對(duì)標(biāo)本中的EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，分析其與臨床病理的關(guān)系。結(jié)果159例樣本中，EGFR基因突變檢出率12.6%(20/159)，突變主要集中在19號(hào)外顯子的缺失和21號(hào)外顯子的點(diǎn)突變。女性患者基因突變檢出率明顯高于男性患者（P＜0.01）。腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌患者基因突變檢出率明顯高于其他組織學(xué)分型（P＜0.01）。高分化患者基因突變檢出率高于中-低分化檢出率（P＜0.05）。EGFR基因突變與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無(wú)關(guān)（P＞0.05）。 結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型及分化程度密切相關(guān)。

肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；表皮生長(zhǎng)因子受體；基因突變

相關(guān)研究表明，表皮生長(zhǎng)因子受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR）在43%～89%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中表達(dá)上調(diào)，參與細(xì)胞增殖、血管生成、抵抗凋亡和腫瘤侵襲，在腫瘤形成和介導(dǎo)瘤細(xì)胞的生物行為上發(fā)揮著重要作用，是目前NSCLC治療的重要靶點(diǎn)之一[1]。該研究就此主要研究非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變情況及其與臨床病理的關(guān)系，旨在為臨床治療提供靶點(diǎn)依據(jù)，現(xiàn)對(duì)2010年1月—2014年1月間來(lái)該院診治的159份非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科收集的159份NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本為研究對(duì)象，術(shù)前都未接受放化療治療。其中男性117例，女性42例，年齡范圍36～78歲，平均59歲，中位年齡61歲。按中位年齡分兩組（4例無(wú)年齡紀(jì)錄）：≤60歲77例，＞60歲78例。組織學(xué)分型：腺癌63例，細(xì)支氣管肺泡癌16例，非腺癌80例（包括鱗癌53例、腺鱗癌10例、大細(xì)胞癌11例、黏液表皮樣癌2例、肉瘤樣癌4例）。

1.2 方法

①DNA提取。取蠟塊腫瘤組織切片，厚度為5～6 μm，5～10片，保存在無(wú)菌專(zhuān)業(yè)管（1.5 mL）中。把二甲苯脫蠟(鞍山市華昊化工廠)、乙醇洗脫二甲苯(青島新銳化學(xué)有限公司)（均由廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院專(zhuān)業(yè)醫(yī)師配置）加入管中，隨后將其晾干。再向每一根管中加入300 μL的裂解液及30 μL的蛋白酶K，水浴（55℃）3 h。100℃下滅活蛋白酶K5至10 min。然后每一根管中加入120 μL的飽和氯化鈉，均勻振蕩20 s，離心處上清，之后加入雙倍體積的乙醇（無(wú)水），零下20℃沉淀2 h。4℃離心20 min，速度為12 000 r/min，棄上清；加入一定量的乙醇（80%，冷），離心，真空抽干。最后利用紫外分光光度儀測(cè)量并保持樣本DNA純度為1.7～2.0之間。②PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：儀器設(shè)備為PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI-2700型），先95℃預(yù)變性，退火1 min，延伸1 min，循環(huán)10次，變性50 s，再分別退火、延伸1 min，循環(huán)30次，72攝氏度延伸10 min?；厥詹⒗肈NA純化試劑盒測(cè)量PCR產(chǎn)物凝膠電泳特異性條帶。③測(cè)序。運(yùn)行PCR程序，利用乙醇純化產(chǎn)物，用測(cè)序儀（美國(guó)ABI3730型）測(cè)序純化后的產(chǎn)物。所得結(jié)果與基因庫(kù)EGFR基因序列核對(duì)，所有病例均經(jīng)正向及反向測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)EGFR基因突變檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變情況分析

159例NSCLC組織標(biāo)本中EGFR基因突變20例 （12.6%），突變主要集中在19號(hào)外顯子的缺失和21號(hào)外顯子的點(diǎn)突變（90.5%），其中20號(hào)外顯子S768I、21號(hào)外顯子L861Q突變同在1例（0.6%）。見(jiàn)表1。

表1 159例EGFR基因突變中常見(jiàn)突變類(lèi)型（例）

2.2 EGFR基因突變與臨床病理關(guān)系分析

在159例NSCLC患者中，女性患者EGFR基因突變率（31.0%，13/42）高于男性患者（6.0%，7/117），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.52，P＜0.01）。腺癌和細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率 （19%，12/63和37.5%，6/16）高于非腺癌患者 （2.5%，2/ 80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.38，P＜0.01）；細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率（37.5%，6/16）高于腺癌患者（19%，12/63），但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.93，P＞0.05）。高分化患者EGFR基因突變率（30.0%，6/20）高于中-低分化患者（10.1%，14/139），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.31，P＜0.05）。EGFR基因突變率與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.72，P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 159例非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與臨床病理關(guān)系分析

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其中約80%是非小細(xì)胞肺癌，盡管隨著手術(shù)、放化療等治療手段的發(fā)展，肺癌的治療效果得到顯著提升，但目前肺癌的預(yù)后仍然很差，患者的5年生存率僅約15%[2]。目前，以吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺釣榇淼尼槍?duì)受體酪氨酸激酶家族中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的靶向藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用給NSCLC治療帶來(lái)了新的曙光[3-5]。EGFR是原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性。相關(guān)文獻(xiàn)表明EGFR能和細(xì)胞外配體結(jié)合形成二聚體，通過(guò)刺激酪氨酸激酶活性讓二聚體出現(xiàn)自身磷酸化，讓信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6]。一旦EGFR基因突變，會(huì)直接參與到腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制等過(guò)程中。EGFR酪氨酸激酶抑制劑可通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞EGFR的特異性結(jié)合阻斷細(xì)胞信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促其凋亡。

文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，不同人種之間EGFR基因突變率存在差異，東亞人群EGFR基因突變率約30%，高加索人群約10%。中國(guó)NSCLC患者EGFR基因總突變率約28.7%。該組福建地區(qū)159份非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中EGFR基因突變檢出率為12.6%，較國(guó)內(nèi)平均數(shù)據(jù)低，可能與檢測(cè)方法及不同的人群和地域有關(guān)，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證[9-10]。

該研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變表現(xiàn)在外顯子18～21，其中以19外顯子缺失、21外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹?，在EGFR基因突變檢出中所占比例分別為19.0%（4/21）、71.4%（15/21），表明上述區(qū)域極有可能是靶向治療的敏感部位。另外，由表2可知，非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度有關(guān)。其中女性患者EGFR基因突變明顯高于男性患者，腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌EGFR基因突變檢出率明顯高于其他分型檢出率。王芳等[11]報(bào)道，細(xì)支氣管肺泡癌及伴有細(xì)支氣管肺泡癌分化特征的腺癌EGFR基因突變率顯著高于普通腺癌，他們認(rèn)為腺癌中無(wú)論細(xì)支氣管肺泡癌成分的多少均預(yù)示EGFR突變的高發(fā)生率及對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的高反應(yīng)率。該研究中細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率高于腺癌患者，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與張靜等[12]報(bào)道一致。該研究還發(fā)現(xiàn)高分化患者EGFR基因突變率高于中-低分化患者。

綜上，非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度息息相關(guān)，參與腫瘤浸潤(rùn)、化療抗拒等過(guò)程，可作為非小細(xì)胞肺癌治療的一項(xiàng)重要靶點(diǎn)。

[1]Scagliotti GV,Selvaggi G,Novello S,et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J].Clin Cancer Res，2004，10(12 Pt2):4227-4232.

[2]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistic[J].CA Cancer J Clin，2006,56（2）：106-130.

[3]Mok TS，wu YL，Thongprasert S，et a1．Gefitinib or carboplatinpaclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J].N Engl J Med，2009，36l(10)：947-957.

[4]Zhou C，Wu YL，Chen G，et a1．Erlotinib versus chemotherapy as firstline treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive nonsmall-cell lung cancer(OPTIMAL,CTONG-0802)：a multicentre，openlabel，randomised，phase 3 study[J].Lancet Oncol，2011，12(8):735-742.

[5]Shi Y，Zhang L，Liu X，et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer (ICOGEN)：a randomised，double-blind phase 3 non-inferiority trial[J].Lancet Oncol，2013，14 (10)：953-961.

[6]Kris MG，Matale RB，Herbst RS，et al.Efficacy of gefitinib,an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，insymptomatic patients with non-small cell lung cancer:a randomized trial[J].JAMA，2003，290(16)：2149-2158.

[7]Wu YL，Zhong WZ，Li LY，et a1．Epidermal growth factor receptor mutations and their correlation with gefitinib therapy in patients with nonsmall cell 1ung cancer：a meta—analysis based on updated individual patient data from six medical centers in mainland China[J].J Thorac Oncol，2007，2（5）：430-439．

[8]王國(guó)慶，谷雅君，王蓉，等.中國(guó)人非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與患者特征關(guān)系的Meta分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2009,10（2）：55-57,60.

[9]張曉彤,李龍蕓,王樹(shù)蘭,等.吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效觀察[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2012（28）:180-183.

[10]Planchard D,LoriotY,Besse B.[ImpactofKRAS in stand-ard treatment of non-small cell lung cancer(NSCLC)pa-tients in 2009:prognostic and predictive value][J]1Bull Cancer,2009,96:S57-S68.

[11]王芳.付莎.湯濤，等.非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變與臨床病理特征的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，2011,40（10）:664-666.

[12]張靜，梁智勇，曾瑄，等.應(yīng)用蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變與病理改變的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，2008,37（5）：294-299.

Non-small Cell Lung Cancer Epidermal Growth Factor Receptor Gene Mutation Detection and Its Relationship with the Clinicopathological Characteristics

DING Yi ZHANG Haiping ZHONG Shan FU Li BAI Dongyu ZHANG Haifang
Pathological Department,The First Affiliated Hospital of Xiamen University,Xiamen,Fujian Province,361003,China

Objective To investigate the non-small cell lung cancer(NSCLC)epidermal growth factor receptor(EGFR)gene mutation and its relationship with clinical pathology.Methods 159 patients with NSCLC were diagnosed and treated in our hospital from January 2010 to January 2014.And the surgical resection specimens of them were analyzed.Gene sequencing method was used to detect the EGFR gene mutation in the specimens,and the relationship between the EGFR gene mutation and clinical pathology was analyzed.Results In 159 samples,the EGFR gene mutation detection rate was 12.6%(20/159).The gene mutations mainly were the deletion in exon 19 and exon 21 point mutation.The gene mutation detection rate of the female patients was significantly higher than that of the male patients(P＜0.01).The gene mutation detection rates of adenocarcinoma and bronchioloalveolar carcinoma were significantly higher than those of other histological types(P＜0.01).The gene mutation detection rate of patients with high differentiation was higher than that of those with medium or low differentiation (P＜0.05).EGFR gene mutation had nothing to do with age,and the metastasis of lymph node (P＞0.05).Conclusion EGFR mutation in patients with non-small cell lung cancer is closely related with the sex,histological type and differentiation degree.

Lung neoplasms;Non-small cell lung cancer;Epidermal growth factor receptor;Gene mutation

R734.2

A

1674-0742（2014）10（a）－0009-03

2014-06-29）

丁毅（1979.12-），男，回族，福建泉州人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：病理學(xué)。

張海萍，E-mail：zhp3398@163.com。