張澤英+袁宗輝

摘要：將卡巴氧殘留標(biāo)示物喹喔啉-2-羧酸（QCA）與γ-氨基丁酸（ABA）衍生成喹喔啉-2-甲酰胺丁酸（QCA-ABA），再與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)作為免疫原（QCA-ABA-BSA），將QCA與卵清白蛋白（OVA） 偶聯(lián)作為包被原（QCA-OVA），建立了豬可食性組織中QCA的間接競爭ELISA檢測方法。結(jié)果表明，最優(yōu)的QCA-OVA包被抗原濃度為4 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為1∶3.2×104，最適檢測范圍為0.2～51.2 ng/mL，最低檢測限為0.6 μg/kg，對豬肌肉和豬肝臟的添加回收率為47.4%～87.7%。

關(guān)鍵詞：卡巴氧；喹喔啉-2-羧酸；ELISA；殘留檢測

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）01-0193-04

Development of an ELISA Method for Screening of Marker Residue of Carbadox in Animal Edible Tissues

ZHANG Ze-ying1，YUAN Zong-hui2

（1.Department of Food Engineering， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430015， China；

2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Food Safety Evaluation， Wuhan 430070， China）

Abstract： Derivatized quinoxaline-2-carboxylic acids a marker residue of carbadox with γ-amino butyric acid（ABA）， was conjugated to BSA to prepare immunogen（QCA-ABA-BSA）， and QCA was conjugated to OVA to prepare coating antigen（QCA-OVA）. Indirect competitive ELISA for QCA derivatizative （QCA-ABA） was established to determine QCA in pig edible tissues. The results of the experiment demonstrated that the optimal concentration of the coating antigen， dilution multiple of polyclonal antibody against QCA-ABA were 4 μg/mL， 1∶3.2×104， respectively. The standard curve of indirect competitive ELISA is also established. The curve has a favorable linearity relation within the concentration range of 0.2～51.2 ng/mL， indicaing that the lowest detection limit is 0.6 μg/kg， with the recovery rate of 47.4%～87.7% in swine muscle and liver tissues.

Key words： carbadox； QCA； ELISA； residue determination

收稿日期：2013-09-29

基金項目：上海市科技興農(nóng)計劃項目（滬農(nóng)科攻字2003B99）

作者簡介：張澤英（1980-），女，四川瀘州人，講師，碩士，主要從事食品分析檢測工作，（電話）027-89665836（電子信箱）27185096@qq.com；

通訊作者，袁宗輝，教授，博士生導(dǎo)師，（電子信箱）zonghui55@163.com。

卡巴氧于1999年被歐盟列為禁用藥，隨后許多國家也出臺了相應(yīng)的法規(guī)限制該藥的使用。然而，由卡巴氧殘留引發(fā)的食品安全問題仍時有發(fā)生。目前，大量出口到歐盟等國的可食性動物組織主要是利用色譜方法，如LC-UV[1，2]、GC-MS[3]和LC-MS-MS[4-7]監(jiān)測卡巴氧及其代謝物的殘留，這些技術(shù)耗時、耗力，并且需要大量資金，不適合高通量篩選，因此很有必要開發(fā)一種快速、低廉的高通量篩選方法來滿足卡巴氧殘留監(jiān)測的需求。ELISA以免疫結(jié)合反應(yīng)為原理，在簡化分析過程、提高速度和降低成本方面具有特殊意義，能彌補上述不足，因而發(fā)展迅速。該研究以卡巴氧殘留標(biāo)示物喹喔啉-2-羧酸（Quinoxaline-2-carboxylic acid，QCA）為半抗原制備多抗，旨在建立一種可用于可食性動物組織中卡巴氧殘留的ELISA 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

喹喔啉-2-羧酸（QCA，≥99%，Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，≥98%，Sigma公司）；卵清白蛋白（OVA，>90%，Sigma公司）；羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

96 孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板（浙江黃巖化學(xué)塑料實驗廠）；Oasis MAX固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）；BIORAD Model 550 型酶聯(lián)免疫檢測儀（日本BIORAD公司）；UV751GD 型紫外可見光分光光度計（上海第三分析儀器廠）；R200D型電子分析天平（賽多利斯公司（德國）；HKCB23 型恒溫磁力攪拌器（溫州市醫(yī)療電器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工抗原和包被原的合成 人工抗原和包被原的合成參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.2 免疫程序及抗體的制備 免疫程序及抗體的制備參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 間接競爭ELISA 基本程序 間接競爭ELISA 基本程序參照文獻(xiàn)[9]。①以一定濃度的包被原復(fù)合物包被96（8×12）孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌2次，每次靜置2 min，于干凈吸水紙上拍干；②以1% BSA溶液封閉，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，拍干；③每列A-G孔加入系列稀釋的被檢測抗原（或磷酸鹽緩沖液）和一定稀釋度的抗體的預(yù)混液，H孔作為零對照，只加特定稀釋度的陰性血清，37 ℃孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，拍干；④加入稀釋度為1∶5 000的羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶標(biāo)記物，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌5次，拍干；⑤加入TMB顯色液，每孔100 μL，室溫避光顯色15～20 min；⑥終止顯色反應(yīng)，每孔加入2 mol/L H2SO4 溶液50 μL，用酶標(biāo)檢測儀測定各孔的OD490值；⑦依據(jù)OD490值，以待測孔OD值大于或等于陰性對照孔的3倍，即判斷為陽性。

1.2.4 間接競爭ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用方陣滴定法和間接競爭ELISA法確定抗原最佳包被濃度、抗體最佳稀釋度、抗體最佳工作量和最佳競爭時間。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 在間接競爭ELISA反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件下，將QCA用二氯甲烷稀釋成0.0、0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 ng/mL系列濃度，加入一定量的衍生試劑和催化劑，37 ℃衍生反應(yīng)，反應(yīng)完畢后47 ℃下氮氣吹干，用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至原始濃度，用間接競爭ELISA測定。所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品吸光值的平均值除以0.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)的吸光值為抑制率（B/B0），以QCA溶液濃度的對數(shù)值（lg[QCA]）為橫坐標(biāo)，以抑制率（B/B0）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.2.6 添加回收率的測定 取2 g組織（豬肉、豬肝）均質(zhì)物，加入5%偏磷酸和10%甲醇溶液各5 mL，振蕩2 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液，再按上述步驟重復(fù)提取1次，合并兩次提取液；在提取液中加入6 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，4 800 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)萃取1次，合并乙酸乙酯層；加入0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）5 mL反萃取，振蕩1 min，提取下清液，再按上述步驟重復(fù)提取1次，合并水相。分別用3 mL甲醇和3 mL水活化Oasis MAX固相萃取柱。取3 mL樣品提取液注入活化后的Oasis MAX固相萃取柱，待樣品提取液全部流出后，分別用0.05 mol/L NaOH溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，除去雜質(zhì)干擾，最后用2%甲酸甲醇溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，45 ℃下氮氣吹干，加入2 mL二氯甲烷溶解殘渣。加入一定量的衍生試劑和催化劑37 ℃衍生反應(yīng)5 h，反應(yīng)完畢后47 ℃下氮氣吹干，向離心管中加入樣本稀釋液2 mL，振蕩30 s，作為試樣溶液，供ELISA方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件

2.1.1 抗原最佳包被濃度 以方陣滴定法中OD值在1.0左右的包被抗原濃度（4 μg/mL）為中心濃度，等差設(shè)5個濃度（2、3、4、5、6 μg/mL）作間接競爭ELISA，曲線斜率最大的抗原濃度為最佳包被濃度（圖1）。結(jié)果表明，最佳抗原包被濃度為4 μg/mL。

2.1.2 抗體最佳稀釋度 方陣滴定確定的抗體稀釋度（1∶3.2×104）為中心濃度，設(shè)計1∶1.6×104、1∶2.4×104、1∶3.2×104、1∶4.8×104、1∶6.4×104 5個濃度作間接競爭ELISA（圖2）。結(jié)果表明，抗體稀釋度為1∶3.2×104時，曲線斜率最大，抗體反應(yīng)最靈敏。

2.1.3 樣品與抗體最佳比例 設(shè)計5個抗體與藥物的工作配比（70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70），作間接競爭ELISA，曲線斜率較大，對ELISA影響較小的抗體工作量為最佳工作量（圖3）。結(jié)果表明，不同的配比對標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的影響較小，為了減少殘留檢測中組織對ELISA反應(yīng)的影響，應(yīng)盡量較少樣品反應(yīng)量，因此選擇樣品與抗體的配比為30∶70。

2.1.4 抗原抗體最適競爭反應(yīng)時間 選擇溫度37 ℃，分別以30、60、90、120 min 4個時間段進(jìn)行競爭反應(yīng)，測其OD490值選擇最佳反應(yīng)時間和溫度（圖4）。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)時間為60 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)品吸光值的平均值除以0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)的吸光值為抑制率（B/B0），以抑制率（B/B0）為縱坐標(biāo)，以QCA溶液濃度的對數(shù)值（lg[QCA]）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。從圖5可知，在0.2～51.2 ng/mL之間，曲線呈良好的線形關(guān)系而且斜率也較大。擬和的線性回歸直線方程為y=-0.240 3x+0.665 4，R2=0.991 1，符合線性關(guān)系的判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中y為B/B0，x為lg[QCA]。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)的lg[QCA]，從而可知其殘留量。

2.3 回收率

豬肌肉和豬肝臟樣本添加QCA濃度為1、5、20 μg/kg，按照前述方法處理后進(jìn)行間接競爭性ELISA，其回收率和變異系數(shù)測定結(jié)果見表1。

表1結(jié)果表明，豬肉、豬肝組織中添加回收率為47.4%～87.7%，批間變異系數(shù)均<30%，符合我國卡巴氧殘留酶聯(lián)免疫檢測要求。

3 小結(jié)與討論

目前國內(nèi)外廣泛使用的測定卡巴氧及其標(biāo)示物殘留量的方法均是色譜法，這些方法不僅需要昂貴的儀器，而且對技術(shù)要求較高，不適合在基層推廣應(yīng)用。免疫檢測技術(shù)具有簡便、快速、靈敏的特點，因此近十多年來在食品中獸藥殘留檢測方面取得了迅速的發(fā)展。

本研究首次報道了卡巴氧殘留標(biāo)示物QCA殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結(jié)構(gòu)簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達(dá)到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術(shù)。該研究將動物組織中的QCA經(jīng)提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進(jìn)行大批量測定等優(yōu)點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標(biāo)示物檢測試劑盒的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

目前采用酶聯(lián)免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的藥物，QCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中只有1個活性基團(tuán)能用于同載體蛋白相偶聯(lián)，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團(tuán)時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

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[4] BOISON J， LEE S， GEDIR R. A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues[J]. Analytica Chimica Acta，2009， 637（1）：128-134.

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（責(zé)任編輯 胡西洲）

本研究首次報道了卡巴氧殘留標(biāo)示物QCA殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結(jié)構(gòu)簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達(dá)到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術(shù)。該研究將動物組織中的QCA經(jīng)提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進(jìn)行大批量測定等優(yōu)點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標(biāo)示物檢測試劑盒的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

目前采用酶聯(lián)免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的藥物，QCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中只有1個活性基團(tuán)能用于同載體蛋白相偶聯(lián)，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團(tuán)時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)任編輯 胡西洲）

本研究首次報道了卡巴氧殘留標(biāo)示物QCA殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，由于QCA分子量較小，分子結(jié)構(gòu)簡單，未能獲得直接捕獲QCA的抗體，只得到針對其衍生物QCA-ABA的特異性抗體。Kevin[10]和Chang等[11]采用衍生動物組織中3-氨基-2惡唑烷酮（AOZ），以檢測其衍生物達(dá)到檢測AOZ殘留物的ELISA檢測技術(shù)。該研究將動物組織中的QCA經(jīng)提取、凈化、衍生成QCA-ABA，用所建立的ELISA方法可檢測動物組織中的QCA殘留量。從建立的工作曲線來看，具有靈敏度高，特異性強，精確度高及能進(jìn)行大批量測定等優(yōu)點。該研究所建立的檢測方法為卡巴氧殘留標(biāo)示物檢測試劑盒的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

目前采用酶聯(lián)免疫檢測法測定藥物殘留的包括氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸克倫特羅、鏈霉素等幾種藥物。不同于氯霉素和磺胺二甲基嘧啶等結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的藥物，QCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中只有1個活性基團(tuán)能用于同載體蛋白相偶聯(lián)，在包被原和免疫原的載體蛋白都連接在這個基團(tuán)時，檢測方法的靈敏度受到一定影響。筆者試圖制備直接針對QCA的特異性抗體，但未能成功。為了簡化卡巴氧殘留ELISA檢測中組織處理過程，制備直接捕獲QCA小分子的特異性抗體更為必要，而這方面的工作有待進(jìn)一步的研究。

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（責(zé)任編輯 胡西洲）