李旭艷+惲冬澤+邵淑麗

摘要：以單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接篩選插有發(fā)夾RNA（Small hairpin RNA，shRNA）干擾片段的重組陽性克隆。以圓滑單菌落為PCR模板，采用載體通用引物直接擴(kuò)增目的片段，質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證 PCR結(jié)果的正確性。結(jié)果表明，在篩選的6個(gè)菌落中均擴(kuò)增出324 bp的目的條帶，進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序分析鑒定，證實(shí)了菌落PCR陽性克隆含有發(fā)夾RNA干擾片段。單菌落PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、可靠、有效篩選重組陽性克隆的方法。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)尉銹CR；重組克??；發(fā)夾RNA

中圖分類號(hào)：Q781；S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）01-0220-02

Application of Individual Bacterial Colonies PCR in Screening

shRNA Recombinant Clone

LI Xu-yan，YUN Dong-ze，SHAO Shu-li

（College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： The individual bacterial colonies were adopted for templates of PCR to screen recombinant clone carrying small hairpin RNA. The PCR amplification with individual bacterial colonies and universal primer was developed to detect targeting fragment. The positive colonies were further confirmed by sequencing. Results showed that among the six clones， the positive band in the size of 324 bp were detected on agarose gel. DNA sequencing confirmed that shRNA template was cloned into plasmid vector successfully. Individual bacterial colony PCR is a simple，rapid，reliable and efficient method for screening the recombinant clones.

Key words： individual bacterial colonies PCR；recombinant clone；shRNA

收稿日期：2013-05-10

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C200624）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（11511447；12511611）

作者簡(jiǎn)介：李旭艷（1982-），女，山東濟(jì)南人，講師，主要從事遺傳學(xué)方面的研究，（電話）0452-2782835（電子信箱）lxy0702@126.com；

通訊作者，邵淑麗，教授，主要從事分子生物學(xué)方面的研究，（電話）0452-2738219（電子信箱）shshl132@163.com。

在基因重組試驗(yàn)中，篩選含有插入目的基因片段的重組陽性克隆常用的方法有快提質(zhì)粒、酶切法、互補(bǔ)插入失活法及雜交篩選法等[1]，這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

近年來，由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase chain reaction，PCR）具有簡(jiǎn)便、快速及靈敏等特點(diǎn)，研究者建立了PCR鑒定陽性克隆的方法，通常以提取的質(zhì)?；蛘吡呀獾木鹤鳛镻CR的模板[2，3]，可以獲得良好的篩選效率。為進(jìn)一步簡(jiǎn)化制備模板的步驟，節(jié)約時(shí)間，本試驗(yàn)以單個(gè)轉(zhuǎn)化菌體為模板，不經(jīng)過任何處理，采用載體通用引物直接擴(kuò)增目的片段，來初步鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌，為該方法的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

T4 DNA ligase、BamHⅠ、HindⅢ購(gòu)自TOYOBO公司，E. coli DH5α、氨芐青霉素（Amp）、PCR試劑盒、pSilencer 3.1-h1 neo（AmpR）載體由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供。

shRNA模板為F，5′-GATCCGAAGGAAAAGAA

ACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTTTCTTTTCCTTCT

TTTTTGGAAA-3′；R，5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAA

GGAAAAGAAACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTTTC

TTTTCCTTCG-3′，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，退火為雙鏈。PCR引物為F，5′-GTTTTCCCAGT

CACGAC-3′；R，5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制備 采用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切pSilencer 3.1-h1 neo載體質(zhì)粒，與退火的帶有相同酶切位點(diǎn)的shRNA模板4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。

1.2.2 單菌落PCR擴(kuò)增 制備除模板DNA和Taq酶外的PCR反應(yīng)體系： 10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL， ddH2O 20.5 μL，上下游引物各0.5 μL，隨后用滅菌牙簽挑取圓滑單菌落，在預(yù)先分格并標(biāo)記數(shù)字的另一LB平皿上點(diǎn)板，然后點(diǎn)入相應(yīng)PCR反應(yīng)體系，完成模板接種，快速加Taq酶，用手指輕彈管壁，瞬時(shí)離心，立即開始擴(kuò)增。設(shè)陰性對(duì)照，加入除了模板以外的所有PCR 反應(yīng)試劑；以pSilencer 3.1-h1 neo空載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s， 55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸1 min，4 ℃保存。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，判斷擴(kuò)增出目的片段是否為真陽性轉(zhuǎn)化子。點(diǎn)板的平皿37 ℃培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3 質(zhì)粒測(cè)序 PCR產(chǎn)物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號(hào)進(jìn)行核對(duì)，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養(yǎng)。小提陽性克隆質(zhì)粒及陽性對(duì)照質(zhì)粒，采用反向引物測(cè)序，由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析，在篩選的6個(gè)菌落中均可擴(kuò)增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預(yù)期基因片斷大小一致，因此推測(cè)這6個(gè)克隆可能為含有發(fā)夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證菌落PCR結(jié)果的正確性，將陽性對(duì)照及隨機(jī)挑選的PCR陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規(guī) PCR技術(shù)是目前分子生物學(xué)技術(shù)中一種常用的鑒定方法，PCR擴(kuò)增的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但常規(guī)PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴(kuò)增的試劑[4]。研究者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個(gè)菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克??；Sathe等[6]將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細(xì)菌直接作為PCR反應(yīng)的模板，而不需要抽提、純化質(zhì)粒DNA，同時(shí)又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗(yàn)沒有采用α互補(bǔ)及酶切法鑒定重組克隆，是因?yàn)樵囼?yàn)中所選用的質(zhì)粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質(zhì)粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中出現(xiàn)的大量假陽性菌落，避免了測(cè)序后才發(fā)現(xiàn)問題將會(huì)帶來的時(shí)間和成本的浪費(fèi)。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照，載體多克隆位點(diǎn)序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測(cè)到這樣小的差異。通過對(duì)陽性對(duì)照質(zhì)粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測(cè)序，結(jié)果驗(yàn)證了菌落PCR的正確性。應(yīng)用單菌落 PCR擴(kuò)增可同時(shí)鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規(guī)菌落PCR相比，簡(jiǎn)化了模板處理的步驟，同樣能夠準(zhǔn)確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[2] 薛國(guó)柱，竇科峰，呂勇剛，等.兩種菌落聚合酶鏈反應(yīng)在抗體庫(kù)篩選中的應(yīng)用比較[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈關(guān)心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質(zhì)粒PCR對(duì)轉(zhuǎn)化菌的篩選[J].免疫學(xué)雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應(yīng)篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（8）：528.

（責(zé)任編輯 趙 娟）

1.2.3 質(zhì)粒測(cè)序 PCR產(chǎn)物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號(hào)進(jìn)行核對(duì)，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養(yǎng)。小提陽性克隆質(zhì)粒及陽性對(duì)照質(zhì)粒，采用反向引物測(cè)序，由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析，在篩選的6個(gè)菌落中均可擴(kuò)增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預(yù)期基因片斷大小一致，因此推測(cè)這6個(gè)克隆可能為含有發(fā)夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證菌落PCR結(jié)果的正確性，將陽性對(duì)照及隨機(jī)挑選的PCR陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規(guī) PCR技術(shù)是目前分子生物學(xué)技術(shù)中一種常用的鑒定方法，PCR擴(kuò)增的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但常規(guī)PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴(kuò)增的試劑[4]。研究者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個(gè)菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克??；Sathe等[6]將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細(xì)菌直接作為PCR反應(yīng)的模板，而不需要抽提、純化質(zhì)粒DNA，同時(shí)又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗(yàn)沒有采用α互補(bǔ)及酶切法鑒定重組克隆，是因?yàn)樵囼?yàn)中所選用的質(zhì)粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質(zhì)粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中出現(xiàn)的大量假陽性菌落，避免了測(cè)序后才發(fā)現(xiàn)問題將會(huì)帶來的時(shí)間和成本的浪費(fèi)。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照，載體多克隆位點(diǎn)序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測(cè)到這樣小的差異。通過對(duì)陽性對(duì)照質(zhì)粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測(cè)序，結(jié)果驗(yàn)證了菌落PCR的正確性。應(yīng)用單菌落 PCR擴(kuò)增可同時(shí)鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規(guī)菌落PCR相比，簡(jiǎn)化了模板處理的步驟，同樣能夠準(zhǔn)確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

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[3] 沈關(guān)心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質(zhì)粒PCR對(duì)轉(zhuǎn)化菌的篩選[J].免疫學(xué)雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應(yīng)篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（8）：528.

（責(zé)任編輯 趙 娟）

1.2.3 質(zhì)粒測(cè)序 PCR產(chǎn)物鑒定為陽性克隆的與平皿上的編號(hào)進(jìn)行核對(duì)，挑取平皿上的陽性克隆少許，接種于2 mL含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min 過夜培養(yǎng)。小提陽性克隆質(zhì)粒及陽性對(duì)照質(zhì)粒，采用反向引物測(cè)序，由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌落PCR篩選陽性克隆

以挑取的單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析，在篩選的6個(gè)菌落中均可擴(kuò)增出324 bp大小的陽性條帶（圖1），與預(yù)期基因片斷大小一致，因此推測(cè)這6個(gè)克隆可能為含有發(fā)夾RNA干擾片段的陽性克隆。

2.2 陽性克隆質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證菌落PCR結(jié)果的正確性，將陽性對(duì)照及隨機(jī)挑選的PCR陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果證明（圖2、圖3），菌落PCR陽性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 討論

常規(guī) PCR技術(shù)是目前分子生物學(xué)技術(shù)中一種常用的鑒定方法，PCR擴(kuò)增的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但常規(guī)PCR的模板制備與純化操作繁瑣，成本較高，而且制備的DNA易攜帶抑制PCR擴(kuò)增的試劑[4]。研究者在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，Gussow等[5]用無菌牙簽挑取單個(gè)菌落到TE緩沖液中，煮沸5 min，漩渦振蕩后短暫離心，用1～2 μL裂解液作為DNA模板，篩選出陽性克?。籗athe等[6]將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)過94 ℃變性1 min處理后，用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)菌破裂釋放出了DNA。因此，可將細(xì)菌直接作為PCR反應(yīng)的模板，而不需要抽提、純化質(zhì)粒DNA，同時(shí)又避免在抽提過程中DNA的損失。

本試驗(yàn)沒有采用α互補(bǔ)及酶切法鑒定重組克隆，是因?yàn)樵囼?yàn)中所選用的質(zhì)粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，與載體的分子量大小差別較大，且酶切下來的短片段在電泳凝膠中的顯示受質(zhì)粒溶液中殘留RNA的干擾，亮度極弱，不能清楚顯示[7]。因此，采用單菌落PCR方法排除連接轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中出現(xiàn)的大量假陽性菌落，避免了測(cè)序后才發(fā)現(xiàn)問題將會(huì)帶來的時(shí)間和成本的浪費(fèi)。PCR選用pSilencer 3.1-h1 neo空載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照，載體多克隆位點(diǎn)序列為61 bp，與shRNA序列相差2 bp，瓊脂糖電泳不能檢測(cè)到這樣小的差異。通過對(duì)陽性對(duì)照質(zhì)粒及菌落PCR鑒定為陽性的克隆測(cè)序，結(jié)果驗(yàn)證了菌落PCR的正確性。應(yīng)用單菌落 PCR擴(kuò)增可同時(shí)鑒定分析很多菌落，不需要貯藏大量候選克隆。與常規(guī)菌落PCR相比，簡(jiǎn)化了模板處理的步驟，同樣能夠準(zhǔn)確有效地篩選出陽性克隆。因此，單菌落 PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的重組克隆篩選的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

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[3] 沈關(guān)心，朱慧芬，張 悅，等.菌落PCR和質(zhì)粒PCR對(duì)轉(zhuǎn)化菌的篩選[J].免疫學(xué)雜志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陳書霞，王曉武，房玉林.單菌落PCR法直接快速鑒定重組克隆[J].微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊剛，陳耀凱，王宇明.自身引物菌落聚合酶鏈反應(yīng)篩選 LoxP序列重組陽性克隆[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（8）：528.

（責(zé)任編輯 趙 娟）