陳虞超 張麗 鞏檑 甘曉燕 石磊 宋玉霞

（寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750002）

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊的生長(zhǎng)特性和抗蟲(chóng)性

陳虞超 張麗 鞏檑 甘曉燕 石磊 宋玉霞

（寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750002）

以非轉(zhuǎn)基因銀河楊（Populus alba×Populus hopeiensis）為對(duì)照，對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊抗蟲(chóng)基因Cry3A的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)基因銀河楊的物候期、生長(zhǎng)狀況和抗蟲(chóng)性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cry3A基因整合穩(wěn)定，在根、莖、葉中RNA和蛋白水平均有表達(dá)，不同組織中Bt蛋白水平差異顯著，莖中Bt蛋白水平最高?？瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊的物候期、生長(zhǎng)狀況未發(fā)生顯著變化，但表現(xiàn)出顯著的抗蟲(chóng)性。

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊 Cry3A基因 物候期 生長(zhǎng)狀況 抗蟲(chóng)性

楊樹(shù)（Populus L.）生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，用途廣，是我國(guó)人工速生用材基地建設(shè)的主要造林樹(shù)種，影響楊樹(shù)豐產(chǎn)林發(fā)展最大的障礙為病蟲(chóng)危害，其中蟲(chóng)害尤甚。楊樹(shù)的害蟲(chóng)主要分為食葉害蟲(chóng)和蛀干害蟲(chóng)，食葉害蟲(chóng)以鱗翅目（Lepidoptera）的楊尺蠖（Apocheima cinerarius）和舞毒蛾（Lymantria dispar）、楊扇舟蛾（Clostera anachoreta）為主，蛀干害蟲(chóng)以鞘翅目（Coleoptera）的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、云斑天牛（Batocera horsfieldi）為主［1，2］。防治這些害蟲(chóng)的傳統(tǒng)方法如化學(xué)藥物防治和人工捕捉等具有一定局限性，因此從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，我國(guó)開(kāi)展了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)培育的研究。眾多研究者通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）等外源抗蟲(chóng)基因，導(dǎo)入不同楊樹(shù)品種中，成功培育出一系列性狀優(yōu)良的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，其中部分已進(jìn)入環(huán)境釋放或商品化階段［3-8］。Cry3A為Bt蛋白編碼基因之一，對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)具有專一的毒殺作用，在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的培育中應(yīng)用較多［9-11］。目前有關(guān)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)培育和利用的研究較多，針對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)生長(zhǎng)特性和抗蟲(chóng)性變化的跟蹤研究較少。鑒于此，本研究以普通銀河楊為對(duì)照，對(duì)已育成的轉(zhuǎn)Cry3A抗蟲(chóng)基因銀河楊抗蟲(chóng)基因的穩(wěn)定性，物候期、生長(zhǎng)狀況和抗蟲(chóng)性變化進(jìn)行較系統(tǒng)

的對(duì)比研究，旨在為抗蟲(chóng)基因銀河楊下一步推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)Cry3A抗蟲(chóng)基因銀河楊［銀白楊（Populus alba L.）×河北楊（Populus hopeiensis Hu et chow）］以CaMV35S為Cry3A基因的啟動(dòng)子，由寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育，并于2004年種植于寧夏回族自治區(qū)銀川市寧夏農(nóng)林科學(xué)院蘆花臺(tái)園林場(chǎng)（東經(jīng)10608'、北緯3838'）。測(cè)試?yán)ハx(chóng)為人工飼養(yǎng)的鞘翅目（Coleoptera）天?？疲–erambycidae）的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）。DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司（貨號(hào)：DP305-02），RNA提取試劑盒購(gòu)自全式金公司（貨號(hào)：ET121-01），RTPCR試劑盒GoScriptTMReverse Transeription System購(gòu)自Promega公司，Bt-Cry3A的ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自于Agdia公司（貨號(hào)：PSA05900），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Cry3A基因的PCR與RT-PCR檢測(cè) 提取抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊DNA，利用PCR方法檢測(cè)Cry3A基因的穩(wěn)定性，引物序列為：5'-ATGACTGCTGATAACAACACGGA-3'和 5'-TTAATTCACTGGAATGAACTCA-3'，擴(kuò)增片段大小為1 794 bp。PCR體系為10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物各1.0 μL，Taq 1.0 μL，DNA 1.5 μL，ddH2O 17 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，53℃復(fù)性40 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。7月中旬，采集轉(zhuǎn)基因銀河楊根、莖、葉，采用試劑盒法提取抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊的總RNA，以楊樹(shù)的ubiquitin基因（Gene ID：7464783）為內(nèi)標(biāo)，利用RT-PCR檢測(cè)抗蟲(chóng)基因Cry3A的反轉(zhuǎn)錄情況；Cry3A的RTPCR引物同PCR引物一致，內(nèi)標(biāo)基因ubiquitin的引物序列為：5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3'和5'-TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3'，擴(kuò)增片段大小為195 bp；擴(kuò)增程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Bt蛋白的檢測(cè) 于7月中旬，采集抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊根、莖、葉組織，然后測(cè)定根、莖、葉中Bt蛋白的含量，具體過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用Bio-Rad xMarkTM酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。

1.2.3 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊生長(zhǎng)特性調(diào)查 采用隨機(jī)抽樣法，選取抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊（簡(jiǎn)稱TG）和普通銀河楊（簡(jiǎn)稱CK）調(diào)查樣株各30株，從2012-2013年，連續(xù)2年對(duì)所有樣株的生長(zhǎng)物候期（包括芽萌動(dòng)期、芽開(kāi)放期、花序孕期、展葉始期、開(kāi)花期、展葉盛期、封頂期、葉始黃期、葉黃盛期、落葉初期、落葉盛期）和形態(tài)特性（包括株高、胸徑、地徑、分支數(shù)、郁閉度）進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.4 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定 于7月中旬，分別采集抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊、普通銀河楊植株的幼嫩枝葉，以容量為1 L的帶透氣蓋塑料培養(yǎng)瓶為飼養(yǎng)容器，飼喂光肩星天牛成蟲(chóng)，每瓶3頭，每個(gè)處理組10瓶，每2 d換一次新鮮枝葉，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)兩個(gè)試驗(yàn)組光肩星天牛成蟲(chóng)15 d內(nèi)總死亡率和死亡指數(shù)。

總死亡率（%）=（飼養(yǎng)末期死亡總數(shù)/初期飼養(yǎng)總數(shù)）×100%

死亡指數(shù)=（∑天數(shù)×當(dāng)天死亡數(shù)）/（總死亡數(shù)×試驗(yàn)總天數(shù)）

2 結(jié)果

2.1 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Cry3A基因的PCR檢測(cè)

通過(guò)PCR方法檢測(cè)Cry3A基因在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊植株中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1所示，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，均存在一條1 800 bp左右大小的條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)與目的基因Cry3A同源性為100%。結(jié)果表明，Cry3A基因在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊植株中穩(wěn)定存在，未發(fā)生基因丟失的現(xiàn)象。

圖1 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Cry3A基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Cry3A基因的RT-PCR檢測(cè)

通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)Cry3A基因在不同組織中的RNA表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示，在抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊植株根、莖、葉的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，均存在一條1 800 bp左右大小的條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)與目的Cry3A基因同源性為100%。結(jié)果表明，Cry3A基因在根、莖、葉中均能表達(dá)。

圖2 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Cry3A基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊Bt蛋白檢測(cè)

通過(guò)ELISA法檢測(cè)Cry3A基因在不同組織中的Bt蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊植株根、莖、葉中Bt蛋白水平分別為16、28和6 ng/g。結(jié)果表明，Cry3A基因在根、莖、葉中均能進(jìn)行Bt蛋白表達(dá)，莖中水平最高；不同組織中Bt蛋白水平存在顯著差異。

圖3 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊不同組織中Bt蛋白水平

2.4 抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊生物學(xué)特性分析

通過(guò)對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊、普通銀河楊的物候期進(jìn)行對(duì)比調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的物候期無(wú)顯著差異（表1）。通過(guò)對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊、普通銀河楊的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行對(duì)比調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在胸徑年均生長(zhǎng)量、地徑年均生長(zhǎng)量、株高年均生長(zhǎng)量、分支數(shù)、郁閉度方面均無(wú)顯著差異（表2）。

表1 轉(zhuǎn)基因銀河楊與普通銀河楊物候期對(duì)比表

表2 轉(zhuǎn)基因銀河楊與普通銀河楊生長(zhǎng)狀況對(duì)比表

2.5 轉(zhuǎn)基因銀河楊抗蟲(chóng)性分析

以普通銀河楊為對(duì)照，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室人工飼喂的方法，對(duì)比分析抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊的抗蟲(chóng)性，結(jié)果如表3所示，飼喂抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊和普通銀河楊的光肩星天牛，總死亡率分別為86.7%、33.3%，死亡指數(shù)分別為0.62、0.24。表明抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊對(duì)光肩星天牛具有顯著的抗性。

表3 轉(zhuǎn)基因銀河楊與普通銀河楊抗蟲(chóng)性的對(duì)比分析

3 討論

外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中丟失、沉默是植物基因工程應(yīng)用中存在的主要問(wèn)題。Meyer等［12］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因移栽至大田后，由于光照、溫度等因素的影響，外源基因的失活程度更顯著，失活的轉(zhuǎn)基因植物數(shù)量也更多。但胡建軍等［13］通過(guò)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，7年生的轉(zhuǎn)基因黑楊依然具有良好的抗蟲(chóng)性，外源抗蟲(chóng)基因表達(dá)正常。本研究對(duì)9年生的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊部分植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cry3A基因在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株中穩(wěn)定存在，未發(fā)生基因丟失的現(xiàn)象?？瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊以CaMV35S作為Cry3A基因的啟動(dòng)子，而CaMV35S屬異源組成型啟動(dòng)子，在受體植株的不同組織器官中均可表達(dá)［14，15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cry3A基因在轉(zhuǎn)基因銀河楊植株的根、莖、葉均可表達(dá)，這可能是CaMV35S啟動(dòng)子的特性所決定的。不同組織間的表達(dá)量差異顯著，這與姜志磊等［16］對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的研究結(jié)論相似，推測(cè)這一現(xiàn)象可能與Bt蛋白的分泌方式、運(yùn)輸途徑和方向等相關(guān)。

外源抗蟲(chóng)基因?qū)胧荏w植株基因組，使受體植株表現(xiàn)出較好的抗蟲(chóng)性，但可能也會(huì)影響植株的新陳代謝，導(dǎo)致其生長(zhǎng)特性等表型發(fā)生變化。呂淑平等［17］研究表明，外源Bt基因在增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因棉花抗性的同時(shí)，還影響了轉(zhuǎn)基因棉花的株高等生長(zhǎng)特性。但本研究發(fā)現(xiàn)，與普通銀河楊相比，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊在物候期、生長(zhǎng)狀況等生長(zhǎng)特性方面不存在顯著變化，這與劉海濤等［18］對(duì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊、楊敏生等［19］對(duì)轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因741楊的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與普通銀河楊相比，抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊對(duì)光肩星天牛具有顯著的抗性，這與張冰玉等［11］對(duì)轉(zhuǎn)Cry3A基因銀腺楊的相關(guān)研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因銀河楊（Populus alba×Populus hopeiensis）的物候期、生長(zhǎng)狀況未發(fā)生顯著變化，但抗蟲(chóng)性顯著；其抗蟲(chóng)基因Cry3A整合穩(wěn)定，在根、莖、葉中RNA和蛋白水平均有表達(dá)，不同組織中Bt蛋白水平差異顯著，莖中Bt蛋白水平最高。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Growth Characteristic and Insect-Resistance of Transgenic Populus alba Populus hopeiensis

Chen Yuchao Zhang Li Gong Lei Gan Xiaoyan Shi Lei Song Yuxia
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Ningxia，Yinchuan 750002）

The stability of insect-resistance gene Cry3A, phenophase, growth status and insect-resistance of transgenic poplar hybrid（Populus alba×Populus hopeiensis）was investigated, non- transgenic Populus alba×Populus hopeiensis as control. The results showed that the Cry3A gene in transgenic Populus alba×Populus hopeiensis integrated stably. The Cry3A gene could be expressed at RNA level and protein level in root, shoot and leaf. The Bt protein level was significantly different in different tissues, and was highest in shoot. The phenophase and growth status of transgenic Populus alba×Populus hopeiensis changed indistinctively. But it showed distinct insect-resistance.

Insect-resistance transgenic Populus alba×Populus hopeiensis Cry3A gene Phenophase Growth status Insectresistance

2014-03-07

國(guó)家林業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目（JJ-2012-07）

陳虞超，男，碩士，助理研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：chenyuchao820321@163.com

宋玉霞，女，碩士，研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：songyx666@163.com