魏穎，谷瑞增，林峰，劉艷，張海欣，蔡木易，*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100027）

烏雞肽免疫調(diào)節(jié)作用的研究

魏穎1，2，谷瑞增1，2，林峰1，2，劉艷1，2，張海欣1，2，蔡木易1，2，*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2.北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100027）

對烏雞肽的基本理化指標(biāo)進行了測定，并對其免疫調(diào)節(jié)活性進行研究。應(yīng)用WST-8法檢測不同濃度烏雞肽對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，以吞噬能力和NO的生成量為指標(biāo)評價烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響。烏雞肽主要含有相對分子量低于1 000U的短肽，對ConA誘導(dǎo)的T-淋巴細胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B-淋巴細胞增殖均有顯著的促進作用。濃度為100μg/mL時，顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能中性紅的能力和NO生成。烏雞肽具有較好的增強免疫調(diào)節(jié)的能力。

烏雞肽；淋巴細胞；巨噬細胞；免疫調(diào)節(jié)

烏雞又稱烏骨雞（Gallus gallus dome sticus Brisson），是一種具有特殊經(jīng)濟價值的珍禽[1-2]。烏雞的皮膚、肌肉、骨頭等部位都呈現(xiàn)烏黑色?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，烏雞內(nèi)含豐富的黑色素，蛋白質(zhì)，B族維生素等18種氨基酸和18種微量元素，膽固醇和脂肪含量卻很低。烏雞肉中粗蛋白含量高達63.79%，比普通大黃雞高1.52倍，鮮肉中氨基酸含量較高，必需氨基酸齊全，且第一、二、三限制性氨基酸含量較高[3-4]，是營養(yǎng)價值極高的滋補品，被人們稱作“名貴食療珍禽”。

中醫(yī)認(rèn)為：烏雞氣味甘、微溫、無毒，有補中止痛、滋補肝腎、益氣補血、滋陰清熱、調(diào)經(jīng)活血、止崩治帶等功效，是補虛勞、養(yǎng)身體的上好佳品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：烏雞含有人體不可缺少的賴氨酸、蛋氨酸和組氨酸，食用烏雞可以明顯調(diào)節(jié)人體免疫功能、延緩衰老、強筋健骨。

民間常將烏雞煮之，飲湯食肉。因此，烏雞的水溶成分是最為廣泛的服用形式，是主要的滋補藥效成分。本研究選取烏雞蛋白為研究對象，將其酶解制備成易于人體吸收、利用的短肽，相對分子量低于1000U。采用體外細胞模型，研究不同濃度的烏雞肽對小鼠脾淋巴細胞增殖和小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響，旨在為烏雞的開發(fā)、利用以及精深加工奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏雞肽干粉：北京中食海氏生物技術(shù)有限公司；小鼠（Balb/c，6～8周齡）：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。刀豆蛋白、脂多糖：Sigma公司；RPMI-1640干粉培養(yǎng)基和胎牛血清：Gibco公司；胰蛋白酶和中性紅：Amresco公司；臺盼藍、紅細胞裂解液、Hepes、NO試劑盒和CCK-8：碧云天生物技術(shù)研究所。緩沖液PBS在實驗室配置，裝瓶滅菌后待用。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra MR多功能酶標(biāo)儀：美國dynex；DL-CJ-IND醫(yī)用型潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈儀制造有限公司；HF90CO2培養(yǎng)箱：上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基礎(chǔ)理化分析

1.3.1.1 水分測定[5]

采用常壓干燥法測定烏雞肽水分含量。

1.3.1.2 灰分的測定[6]

采用灼燒法測定烏雞肽灰分含量。

1.3.1.3 脂肪含量測定[7]

采用索式提取法測定烏雞肽脂肪含量。

1.3.1.4 蛋白質(zhì)含量的測定[8]

采用凱氏定氮法測定烏雞肽蛋白質(zhì)含量。

1.3.1.5 分子量分布

1）液相色譜條件

色譜柱：TSKgelG2000 SWXL 300mm×7.8mm（日本TOSOH公司）；流動相：V（乙腈）：V（水）：V（三氟乙酸）=45：55：0.1；檢測器：PDA檢測器；檢測波長：UV220 nm；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10μL。

2）相對分子量校正曲線制作

四種不同相對分子質(zhì)量的肽標(biāo)準(zhǔn)品為：細胞色素C（MW12500），桿菌酶（MW1450），乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（MW451），乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（MW 189）。

分別用流動相配制成0.1%（W/V）不同相對分子質(zhì)量的肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用孔徑為0.2μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后分別進樣，得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lgMW）對保留時間作圖得到相對分子質(zhì)量校正曲線及其方程。

3）樣品的制備

稱取樣品20.0mg于10mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，上機進樣。

4）實驗數(shù)據(jù)分析與處理

將制備的樣品溶液在上述色譜條件下分析，然后用數(shù)據(jù)處理軟件將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算，即可得到樣品的肽的相對分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一化法計算相對分子質(zhì)量分布范圍[9]。

1.3.2 烏雞肽對小鼠淋巴細胞增殖的影響

1.3.2.1 小鼠脾細胞懸液的制備

將小鼠（Balb/c）拉頸處死，于75%乙醇中浸泡5min進行消毒處理，無菌分離完整脾臟，用PBS沖去浮血，剝除結(jié)締組織及脂肪成分。注射器吸取約5mL PBS，輕輕插入脾內(nèi)吹出細胞，重復(fù)操作數(shù)次至脾外膜透明，剩余脾組織剪成大小1mm3小塊，剪碎后置于小燒杯上的200目不銹鋼濾網(wǎng)上，用注射器針芯研磨，PBS液洗滌，收集沖洗液至離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入3 mL紅細胞裂解液，靜置2 min，加入10mL PBS終止反應(yīng)，離心（1 200 r/min，5 min）棄上清，用PBS液洗兩次，離心（1 200 r/min，5 min），用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基洗一次，離心（1 200 r/min，5min），棄上清。加適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和10mmol/LHepes）。調(diào)整細胞濃度至2×106個細胞/mL，臺盼蘭染色檢測細胞存活率大于95%。

1.3.2.2 烏雞肽對脾淋巴細胞增殖的影響

將脾細胞懸液（2×106個細胞/mL）按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中，再添加10μLConA/LPS（5μg/mL）和10μL不同濃度的樣品溶液，每個濃度做6次重復(fù)，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

將脾細胞懸液（2×106個細胞/mL）按100μL/孔加入到96孔培養(yǎng)板中，再添加10μLConA/LPS（終濃度為5μg/mL）或不添加ConA，10μL樣品溶液（終濃度為1、10、50、100、200和400μg/mL），設(shè)置對照組、模型組和樣品組，每組做6次重復(fù)，將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

選用CCK-8試劑盒反映樣品對脾細胞和淋巴細胞增殖能力，結(jié)果用刺激指數(shù)（SI）表示，計算如下：

1.3.3 烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響

1.3.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞的制備

Balb/c小鼠，于實驗前3天腹腔注射1.5mL 4%肉湯淀粉溶液。拉頸處死小鼠，于無菌工作臺上將其腹部皮膚剝離，用一次性注射器向腹腔內(nèi)注入RPMI-1640不完全培養(yǎng)液4mL，輕柔腹部2min～3min，用一次性注射器取其腹部液體，反復(fù)2次～3次。1 200 r/min離心8min收集細胞，洗滌2次，在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度達1×106個/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，將細胞培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h，吸棄上清，用預(yù)溫培養(yǎng)基洗去未貼壁細胞，再加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，制備96孔板巨噬細胞單層。每只小鼠可產(chǎn)生2×106～3×106細胞，其中90%為巨噬細胞。

1.3.3.2 烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的測定

陽性對照組每孔加入10μLLPS（濃度30μg/mL），試驗組每孔加入10μL樣品，試驗組分為LPS與提取物共同作用組和提取物單獨添加組兩種。陰性對照組、陽性對照組和試驗組各設(shè)6個復(fù)孔，于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

培養(yǎng)24 h后，用預(yù)溫的無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每孔加入200μL預(yù)溫的0.1%中性紅溶液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h；傾去上清液，用預(yù)溫RPMI-1640培養(yǎng)液清洗三遍，洗去未被吞噬的中性紅；每孔加入200μL細胞溶解液（含1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸的50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液），室溫下放置2h～3 h，待細胞溶解后，用酶標(biāo)儀測定OD550值。吞噬指數(shù)（Pinocytosis index，PI）計算如下：

1.3.3.3 烏雞肽對巨噬細胞NO生成量的影響

小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)樣品24 h干預(yù)后，收集上清液，依據(jù)NO試劑盒說明書測定NO生成量。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，并采用組間t檢驗，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏雞肽基礎(chǔ)理化性質(zhì)分析

由實驗得出的烏雞肽基礎(chǔ)理化指標(biāo)結(jié)果見表1。烏雞肽中87.69%以上為蛋白，相對分子量低于1 000U的組分總共占96.88%。研究表明，肽的生物活性與分子量大小有關(guān)，能在體內(nèi)起活性作用的肽大多是1000U以下的小肽[10]。如果按氨基酸的平均分子量137 U來計算，本研究選取的烏雞肽多是八肽以下的低聚肽。

表1 烏雞肽基礎(chǔ)理化成分含量Table1 Data of compositions analysis for Black-bone chicken peptide

2.2 烏雞肽對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

烏雞肽對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響見圖1。

圖1 烏雞肽對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.1 Effect of oligopeptides from Black-bone chicken on the proliferation of murine splenocytes.

如圖1所示，烏雞肽單獨作用能夠刺激小鼠脾細胞增殖。與對照組相比，烏雞肽在作用濃度50μg/mL～1 000μg/mL之間時，其SI值為1.08～1.19。濃度為500μg/mL時，SI值達到最大1.19。

淋巴細胞在有絲分裂原如ConA、LPS等的刺激下，其形態(tài)和代謝會發(fā)生一系列的改變，轉(zhuǎn)化為母細胞并分化增殖。其中ConA刺激T細胞增殖，LPS刺激B細胞增殖。因此根據(jù)非特異性促有絲分裂原激活T、B細胞增殖反應(yīng)的程度，可推測T、B細胞識別特異性抗原增殖反應(yīng)。烏雞肽對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖見圖3。與對照組相比，烏雞肽對小鼠脾T淋巴細胞增殖有促進作用，并呈量效關(guān)系（r=0.867 4，P＜0.01），在五個作用濃度范圍內(nèi)，除1 000μg/mL外均有極顯著差異（P＜0.05）。對照組和烏雞肽（100μg/mL）組的SI值分別為1.78和2.59。烏雞肽（100μg/mL）使ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細胞增殖上升了46%。

烏雞肽對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細胞增殖見圖1，烏雞肽對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細胞增殖具有促進作用，但是量效關(guān)系不明顯。在濃度為100μg/mL時，SI值為1.22。

2.3 烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響

圖2 烏雞肽對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.2 Effect of oligopeptides from Black-bone chicken on the proliferation of murine peritoneal macrophages

烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響見圖2。與對照組相比，烏雞肽在50μg/mL～1 000μg/mL之間具有顯著的促進小鼠腹腔巨噬細胞的增殖，呈U-型量效關(guān)系（r=0.96，P＜0.01）。

巨噬細胞有3種活化狀態(tài)，靜息狀態(tài)、致敏狀態(tài)和亢奮（活化）狀態(tài)。當(dāng)機體或局部未受到病原體等的刺激時，巨噬細胞等常處于靜息狀態(tài)，胞體較小，細胞器較不發(fā)達，幾乎不運動，但壽命較長而更新率低。在LPS的刺激下，巨噬細胞從靜息轉(zhuǎn)向活化，細胞增大，代謝增強，溶酶體增多，細胞的變形運動及吞噬能力均增強[11-12]。如圖3A所示，隨著作用濃度的增加，烏雞肽對活化的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響變化不明顯。當(dāng)濃度為1000μg/mL時，吞噬指數(shù)PI達到最高為1.42。

圖3 烏雞肽對LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞活性的影響Fig.3 Impacts of oligopeptides from Black-bone chicken on cell viability by LPS-stimulated mice peritoneal macrophages

巨噬細胞經(jīng)激活后，可產(chǎn)生大量的細胞毒分子（如，NO等），這些細胞毒分子對清除外來微生物有著重要的意義。烏雞肽對小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量的影響見圖3（b）。由圖可以看出，烏雞肽對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞NO生成量均有促進作用，隨濃度變化呈倒U-型關(guān)系。當(dāng)濃度為100μg/mL時，NO生成量為對照組的1.21倍（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究選取易于人體吸收利用的小分子量烏雞肽，對其免疫調(diào)節(jié)作用進行研究。由實驗結(jié)果可知烏雞肽的五個作用濃度對小鼠脾細胞增殖以及絲裂源誘導(dǎo)的T-淋巴細胞和B-淋巴細胞的增殖均有不同程度的促進作用。小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，烏雞肽濃度為100μg/mL和1 000μg/mL時顯著促進巨噬細胞的吞噬能力，在50μg/mL～1 000μg/mL時，烏雞肽均促進巨噬細胞NO的生成。綜合淋巴細胞增殖實驗和小鼠腹腔巨噬細胞活力的實驗結(jié)果可以得出：烏雞肽在100μg/mL時促進淋巴細胞增殖和促進腹腔巨噬細胞活力的效果最好。

實驗證明：烏雞肽是一種優(yōu)秀的營養(yǎng)物質(zhì)來源，本研究為研發(fā)免疫營養(yǎng)調(diào)節(jié)的功能食品提供了理論依據(jù)，同時也為烏雞肽的開發(fā)利用和精深加工奠定了實踐基礎(chǔ)。

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The Effect of Black-bone Chicken Peptide on Immunomodulatory

WEI Ying1，2，GU Rui-zeng1，2，LIN Feng1，2，LIU Yan1，2，ZHANG Hai-xin1，2，CAI Mu-yi1，2，*
（1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China；2.Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100027，China）

The basic physical and chemical indicators of Black-bone chicken peptide were measured，and its immunomodulatory activity was study.The effect of Black-bone chicken peptide on the proliferation of murine splenocytes was detected by WST-8.The effects of Black-bone chicken peptide on phagocytic activity and the No production by macrophages were studied in order to evaluate the cell viability of mouse peritoneal.The relative molecular weight of Black-bone chicken peptide was less than 1 000U.Black-bone chicken peptide significantly stimulated ConA-and LPS-stimulated splenocyte proliferation，and significantly promoted murine peritoneal macrophage phagocytic ability of neutral red and the NO production at100μg/mL.Black-bone chicken peptide has good immunomodulatory effect.

Black-bone chicken peptide；lymphocytes；macrophages；immune regulation

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.001

2013-09-07

十二五國家科技支撐項目（No.2012BAD33B04）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（No.2013AA102205-02）；科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項目（No.Z131110000513026）；北京市科技計劃項目（No.Z131100003113010）

魏穎（1981—），女（漢），工程師，博士，研究方向：功能食品。

*通信作者