韓瑨，劉振民，郭本恒，吳正鈞

（乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

檸檬明串珠菌的研究進展

韓瑨，劉振民，郭本恒，吳正鈞*

（乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436）

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）是明串珠菌屬的重要成員，可以合成胞外多糖如右旋糖苷、產生具有廣譜抑菌作用的細菌素等，具有潛在的應用價值。概述1993～2013年間對檸檬明串珠菌在代謝產物、分子生物學以及食品行業(yè)應用方面的研究進展。

檸檬明串珠菌；胞外多糖；細菌素；遺傳學

檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）是明串珠菌屬（Leuconostoc genus）乳酸菌的一種，為革蘭氏陽性菌，G+C含量40.0%（L.citreum NCDO 1837T），其細菌學分類隸屬于細菌界（Bacteria）－厚壁菌門（Firmicutes）－芽孢桿菌綱（Bacilli）－乳桿菌目（Lactobacillales）－乳桿菌科（Lactobacillaceae）－明串珠菌屬（Leuconostoc）。與其它明串珠菌等乳酸菌的親緣關系見圖1[1]。

自然界中的L.citreum主要存在于綠色植物及其根部[2]，此外，哺乳動物乳汁[3]、傳統(tǒng)發(fā)酵品如泡菜[4]和發(fā)酵面團[5]等也可作為篩選的重要來源。

縱覽近二十年來對L.citreum的相關報道后可以發(fā)現，對L.citreum研究的深度與廣度在不斷擴展，包括菌株的篩選[6-7]、培養(yǎng)基的優(yōu)化[8]、代謝產物的分析[9]、菌株質粒的特性[10]及其在食品行業(yè)的應用[4]，均表明L. citreum正受到越來越多的關注。本文主要從L.citreum的代謝產物、分子生物學研究及食品行業(yè)應用三方面對國內外的相關報道進行概述。

圖1 L.citreum與其他乳酸菌的親緣關系Fig.1 Phylogenetic relationship between L.citreum and other lactic acid bacteria

1 L.citreum的代謝產物

1.1 多糖

右旋糖苷（Dextran，一種由D-葡萄糖以α-1，6糖苷鍵鍵合而成的葡聚糖高分子化合物）是由右旋糖苷蔗糖酶（Dextransucrase，EC 2.4.1.5，DSR）代謝蔗糖產生的一種多糖，目前用于商業(yè)用途的右旋糖苷大多來自L.mesenteroides，而對L.citreum多糖的研究報道相對較少。Maina NH等以核磁共振技術分析了L.citreum E497的右旋糖苷結構，發(fā)現該結構除了大部分的α-1，6糖苷鍵之外，還包含了11%α-1，2糖苷鍵和3.5% α-1，3糖苷鍵，屬于Ⅰ型右旋糖苷的特征結構[11]。Son MJ等對一株篩選自韓國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜Dongchimi的L.citreum S5進行了產糖條件的優(yōu)化，結果表明在化學合成培養(yǎng)基添加1.5%脫脂乳和0.5%馬鈴薯粉可顯著提高菌株的生物量，促進蔗糖的轉化，增加發(fā)酵液中右旋糖苷的積累量。添加脫脂乳和馬鈴薯的化學合成培養(yǎng)基經L.citreum S5代謝產生的右旋糖苷分子量均為1 100 ku左右，而未添加的發(fā)酵液中多糖分子量則為1 100 ku（70%）、2 000 ku（30%）[12]。2008年，L. citreum HJ-P4因其在低溫（10℃）下優(yōu)良的生長特性和多糖合成能力從韓國泡菜Kimchi中被篩選得到。在此溫度下，L.citreum HJ-P4增殖后的菌數比L. mesenteroides B-512高出2倍以上，并保留了80%的最大DSR合成能力，這種低溫下可快速生長和產糖的特性為L.citreum HJ-P4參與工業(yè)化生產Kimchi提供了理論依據[13]。RabeloMC等比較了L.citreum NRRL B-742在化學合成培養(yǎng)基和蘋果汁培養(yǎng)基中生長后獲得的DSR粗酶的穩(wěn)定性，結果表明在25℃、pH 6.5的條件下，DSR粗酶在后一種培養(yǎng)基中可保持良好的穩(wěn)定性達48 h[14]。此外，部分報道涉及L.citreum DSR的異源表達，如表1所示。

表1 L.citreum DSR異源表達的報道Table1 Partial published results of heterologous expression of DSR from L.citreum

菊粉（Inulin，一種主要由果糖以β-2，1糖苷鍵聚合而成的果聚糖）是明串珠菌通過菊粉蔗糖酶（Inulosucrase，EC 2.4.1.9，ISR）代謝蔗糖產生的另一種多糖，具有降血糖、助消化、改善新陳代謝等益生功能。2002年，Olivaries-Illana V等從墨西哥傳統(tǒng)谷物發(fā)酵飲料Pozol中獲得一株L.citreum CW28，通過特殊處理，由其細胞膜上分離得到一種分子量為170 ku的果糖基轉移酶（Fructosyltransferase，EC 2.4.1.9，FTF），核磁共振結果顯示，該酶轉化蔗糖形成的多聚物具有與菊粉類似的結構，這是首次在Streptococcus mutans以外的微生物中發(fā)現ISR[19]。將該菌株的ISR編碼基因進行克隆、表達于E.coli.，分析后發(fā)現該ISR的結構相當特殊：其N-末端與不同微生物來源的葡萄糖基轉移酶（Glucosyltransferase，GTF）的可變區(qū)相似，催化區(qū)與其他微生物來源的FTF相近，C末端則與L.mesenteroides NRRLB-1355來源的交替蔗糖酶（Alternansucrase，EC 2.4.1.140，ASR）與葡聚糖結合的部位類似。截去C末端的ISR基因依然可在E.coli.中成功表達并合成菊粉，但缺失了熱穩(wěn)定性，這是首次報道ISR兼有GTF和FTF的結構特征[20]。研究表明，在L.citreum CW28產物中高分子量的菊粉主要由細胞膜上的ISR合成，而低分子量部分菊粉的合成則與發(fā)酵液中的游離酶有關。在蔗糖濃度25%的優(yōu)化條件下，L.citreum CW28的ISR對底物的轉化率最高可達76%[21]。DELMORALS等通過截除、倒位的方法確定了L.citreum CW 28在進化過程中其FTF獲得的額外區(qū)域的功能，主要與酶的穩(wěn)定性、反應動力學和特異性、尤其是水解與轉糖基作用的比例有關[22]。

1.2 乳酸鹽

乳酸鹽（Lactate）是乳酸菌發(fā)酵糖代謝的主要終產物，根據構型不同可分為D-乳酸鹽（D-Lactate）和L-乳酸鹽（L-Lactate），兩者均由其對應的乳酸脫氫酶合成得到。其中L-乳酸脫氫酶（L-Lactate Dehydrogenase，簡稱L-LDH）與細菌、植物和動物有同源關系，而D-乳酸脫氫酶（D-Lactate Dehydrogenase，簡稱DLDH）的結構與短鏈脂肪酸脫氫酶有一定同源性，值得關注的是，未成年人或病人過量攝入D-乳酸鹽會引起代謝性應激反應。有報道指出，朝鮮泡菜Kimchi中L. citreum發(fā)酵產生的乳酸鹽絕大部分屬于D構型，L-乳酸鹽相對較少[23]。為了提高L-乳酸鹽的產量，JINQ等借助穿梭載體pLeuCM將植物乳桿菌的L-LDH克隆并引入L.citreum中，獲得的轉化子成功將該基因轉錄和表達，產物中的L-乳酸鹽的增加與D-乳酸鹽的少使兩種異構體的比例發(fā)生變化，但乳酸鹽總量沒有顯著增加，這是首次以調節(jié)中央碳通量的方式將代謝工程應用于明串珠菌的改造[24]。采用穿梭載體pMBLT02，L.citreum 95成功地過量表達了D-LDH，實驗結果顯示，補充了14%葡萄糖的培養(yǎng)液經轉化株發(fā)酵后D-乳酸產量可達61 g/L，比對照組的產量高6倍以上[25]。

1.3 細菌素

細菌素（Bacteriocin）是產生菌以抑制同源種或近似種的生長為目的所分泌的肽類抗菌物質，通常由質粒編碼產生，主要通過吸附并作用于敏感菌細胞表面的特異受體從而達到抑菌的目的。目前關于明串珠菌產細菌素的報道，，主要有Mesentericin Y105（L. mesenteroides）、L.gelidum（eucocin A-UAL 187）、L. carnosum（carnosin 44A）、L.paramesenteroides（leuconocin S）等，卻較少涉及的L.citreum產細菌素功能。Chang JY等篩選得到一株產細菌素的L.citreum GJ7，這種細菌素命名為Kimchicin-GJ7，分子量在3 500 u左右，不但熱穩(wěn)定性強、耐酸堿能力佳，而且對廣譜微生物有拮抗作用。以滅活的細菌素敏感菌株Lb. plantarum KFRI 464為環(huán)境刺激因素可提高Kinchicin-GJ7的產量。進一步的研究發(fā)現，Lb.plantarum KFRI464可產生一種使L.citreum GJ7增產細菌素的誘導因子，以其N末端的一段由16個氨基酸組成的序列為模板合成的16肽對Kinchicin-GJ7的誘導效果僅比完整誘導因子的效果低10%左右。這是首次報道關于一種細菌產物影響另一種細菌的細菌素產量[26]。在優(yōu)選的發(fā)酵條件下，使用經上述誘導方式獲得的細菌素高產菌株L.citreum GJ7來發(fā)酵泡菜，可以控制泡菜的后熟程度和菌群組成，同時延長商品的貨架期，此項研究為發(fā)酵制品企業(yè)提供了敞開式、非無菌發(fā)酵過程中控制微生物生長的理論依據[27]。研究表明，L.citreum的乳酸發(fā)酵過程可以顯著延緩3種真菌（Cladosporium sp.YS1，Neurospora sp.YS3，Penicillium crustosum YS2）在米團中的增殖，這種抑菌效果比添加0.3%丙酸鈣要好得多，乳酸發(fā)酵時的副產物如乳酸和乙酸等有機酸被認為是主要抑菌物質，因此，L.citreum等乳酸菌在控制米團發(fā)酵、延長年糕保存期等方面有一定優(yōu)勢[28]。

1.4 其他代謝產物

通過體外瘤胃發(fā)酵的方法，Baek E等發(fā)現L.citreum TSD-1在發(fā)酵紅絨球和象草時，pH不斷降低，同時伴有氨氣和戊酸鹽產量增加的現象[9]。Rodriguez-Alengria ME等對L.citreum IS的ISR催化區(qū)域IslA4進行定位突變，其中突變株S425A喪失了原有產菊粉的能力，只分解蔗糖與合成低聚果糖。在0.67mol/L蔗糖溶液里，低聚果糖轉化率可達65%，進一步研究表明，這種果糖基轉化過程符合一級動力學規(guī)律，因此，S425A表達的ISR可用于以蔗糖為底物合成低聚果糖[29]。對大多數L.citreum而言，甘露醇是其代謝蔗糖的一類副產物，然而OtgonbayarGE通過研究發(fā)現，在優(yōu)化條件下（pH 6.50，30℃），L.citreum 91348P發(fā)酵改良的MRS培養(yǎng)基（葡萄糖∶果糖1∶2）時合成甘露醇的最大效率為14.38 g/L·h，終產物總獲率達到86.6%，說明該菌株在含果糖食品發(fā)酵方面具有一定應用前景[30]。Leathers TD等發(fā)現L.citreum和L.mesenteroides不同菌株之間形成生物膜的能力存在差異巨大，但菌株形成生物膜的能力與菌株所產的多糖類型無關[31]。人參皂苷是人參重要的功能組分，具有調節(jié)免疫、降血壓等益生作用，但不易被人體吸收，L.citreum LH1卻可將人參皂苷Rb1轉化為易吸收的復合物K，后者可通過抑制癌細胞入侵、阻斷癌細胞形成的方法來遏制癌細胞擴散，該轉化線路如圖2所示[32]。

圖2 L.citreum LH 1將人參皂苷Rb1轉化為復合物K的線路Fig.2 Bioconversion pathway of ginsenoside Rb1 to compound K by Leuconostoc citreum LH 1

2 L.citreum的分子生物學研究

2008年，Kim JF等完成了L.citreum KM20的全基因組測序，發(fā)現了4個環(huán)狀質粒和一些可能與發(fā)酵和益生功能相關的基因[33]。來源于法國小麥發(fā)酵面團的三株檸檬明串珠菌（L.citreum LBAEC10，L.citreum LBAEC11 and L.citreum LBAEE16）也在2012年被測序并構建成基因組圖譜[34]。Park J等從L.citreum IH3中分離獲得一種隱秘質粒pIH01（1.8 kb），單一的開放閱讀框（Opening Reading Frame，ORF）結構表明該質粒的復制模式為滾環(huán)復制，其產物與L.mesenteroides FR52來源的質粒pFR18所編碼的復制酶蛋白有較高的相似度（64%），因此，pIH01的衍生質?？捎糜趯γ鞔榫M行遺傳學的研究[35]。L.citreum C4的pCC3是另一個被深入研究的質粒，該質粒堿基對長度達3338bp兼有3個ORF，其中ORF3與θ型質粒pTXL1有高度同源性，ORF3所在片段含有一個功能性質粒的復制子。以pCC3為基礎構建成的穿梭質粒pUCC3E1可在E.coli TG1和克隆宿主菌L.citreum C16及L.citreum GJ7中復制表達[36]。由來源于L.citreum CBNU75的另一種隱秘質粒pCB18（1，821 bp，G+C 39.2%）與大腸桿菌質粒pEK104構建的穿梭載體pLeuCM，可通過滾環(huán)復制的方式，完成在E.coli.和L.citreum中的復制，而且遺傳性相當穩(wěn)定。實驗表明，克隆了植物乳桿菌β-半乳糖苷酶編碼基因的pLeuCM可以在L.citreum中成功表達，同時，pLeuCM在L.citreum，L.mesenteroides，Lb.plantarum，Lb.reuteri，Lc.lactis，Streptococcus thermophilus，Weissella confusa和Oenococcus oeni中均可被復制。因此，質粒pLeuCM可以成為多種乳酸菌之間進行基因傳遞的有效工具[10]。

上述研究大多針對L.citreum的特定質粒，在L. citreum相關的分子生物學報道中，還有一部分是將L. citreum作為外源基因表達的宿主菌的研究。Park JY等以穿梭載體為手段，將L.mesenteroides SY1的α-半乳糖苷酶編碼基因引入L.citreum KCTC3526，該基因在宿主菌中獲得成功表達[37]。Eom HJ等通過同樣的方法完成了α-淀粉酶在L.citreum中的異源表達[38]。

3 L.citreum在食品行業(yè)的應用

Choi IK等利用L.citreum的高產酸能力，在泡菜制作工藝中人為添加L.citreum IH22來加快發(fā)酵過程中pH的下降速率，以此法制成的泡菜比未添加L.citreum IH22制成泡菜保持期更長[39]。L.citreum的這種高產酸能力同樣被運用于北京豆汁的生產工藝中，北京豆汁中主要產酸微生物為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），且分別占72%與26%，乳酸菌發(fā)酵導致可溶性蛋白及可溶性糖含量下降，游離氨基酸含量迅速累積，綠豆內源蛋白酶與淀粉酶活性下降，微生物蛋白酶活性增強[40]。Delgerzaya P等嘗試用L.citreum HJ-P4發(fā)酵麥芽汁來探索一種新型益生菌飲料，發(fā)現發(fā)酵液中功能性代謝產物（有機酸、功能性糖等）的濃度及其風味主要受到麥芽烘焙條件和發(fā)酵條件的影響[41]。經實踐證明，含糖14.08%、檸檬香精0.98%的麥芽汁經S.cerevisiae和L.citreum HJ-P4相繼發(fā)酵后的產物最受消費者歡迎，此項研究為L.citreum在功能性飲品發(fā)酵制備方面的應用提供了理論依據[42]。ChoiH等在酵母面包制作過程中添加了L.citreum HO12參與發(fā)酵的面團，此法顯著延緩了真菌、芽孢桿菌等腐敗菌在面包產品中的生長，這是利用了L.citreum產細菌素的特性[4]，這種特性使L.citreum被廣泛地應用于延長產品貨架期等方面[27-28]。

4 展望

明串珠菌最初被發(fā)現于20世紀40、50年代，對明串珠菌的研究工作僅限于培養(yǎng)條件分析等技術層面，直到20世紀末，尤其是近年來，有關明串珠菌的研究才慢慢開始升溫，包括了L.citreum培養(yǎng)基的優(yōu)化[8]、生長保存的特性[43-45]、致病性[46-48]、調節(jié)免疫[49]、功能性酶的發(fā)現[50]、與L.mesenteroides的分子差異[51]和產糖差異[5]等方面，這些研究提高并深化了對L.citreum的認識。

盡管L.citreum代謝產物豐富（有機酸、多糖、細菌素等），作為研究對象，具有廣泛用途（質粒供體、宿主菌等），但與明串珠菌其它菌株或其它乳酸菌相比，其應用特性往往不夠突出。例如，L.citreum的產糖能力普遍低于L.mesenteroides，商業(yè)用途的多糖合成菌株基本采用L.mesenteroides，因此，目前對L.citreum的研究依然處于技術層面。

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Progress in Study on Leuconostoc citreum

HAN Jin，LIU Zhen-min，GUO Ben-heng，WU Zheng-jun*
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Bright Dairy&Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Leuconostoc citreum is an important member of Leuconostoc genus with application potential i.e. production of polysaccharides including dextrans，and bacteriocins with antagonistic activity against a broad spectrum of microorganisms.In this article，the research progress in metabolites，genetics as well as present and potential application in fermented food of Leuconostoc citreum in update was reviewed.

Leuconostoc citreum；exopolysaccharide；bacteriocin；genetics

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.032

2013-05-13

“十二五”國家科技支撐計劃課題：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開發(fā)（2013BAD18B01）；“十二五”國家863項目：優(yōu)良益生菌高效篩選與應用關鍵技術（2011AA100901）

韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學專業(yè)。

*通信作者