劉　熹　綜述　余　晨　審校

急性腎損傷和慢性腎臟病發(fā)病率逐年升高，患者進(jìn)展至終末期腎病需維持性透析治療，其病死率高，且加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。腎臟移植存在器官短缺、免疫排斥反應(yīng)等問題，故需尋找更好的治療方法。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)可定向分化為腎系細(xì)胞，參與腎臟損傷后的修復(fù)，且其來源于體細(xì)胞，取材簡(jiǎn)便，無明顯免疫排斥反應(yīng)，避免倫理學(xué)爭(zhēng)議，因而在腎臟再生領(lǐng)域最具發(fā)展前景。

干細(xì)胞分類及比較

干細(xì)胞是一類具有高度增殖和多系分化能力的細(xì)胞。干細(xì)胞根據(jù)分化潛能大小分為多能干細(xì)胞和多功能成體干細(xì)胞(圖1)[1]。多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和iPSC，可分化為內(nèi)、中、外三胚層細(xì)胞。多功能成體干細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、造血干細(xì)胞(HSC)和生殖細(xì)胞。獲取ESC需毀損胚胎，細(xì)胞來源受限，體內(nèi)注射可致畸胎瘤。MSC及HSC體外培養(yǎng)、擴(kuò)增相對(duì)容易，但其分化潛能較ESC和iPSC減弱。

圖1　干細(xì)胞種類及分化潛能[1]

iPSC的產(chǎn)生及鑒定

2006年，Yamnaka研究小組從24個(gè)候選基因中篩選出四個(gè)基因：Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將這4個(gè)基因的cDNA導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞在ESC培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)成胚胎干細(xì)胞樣集落，并表達(dá)ESC絕大部分標(biāo)志基因，移植入裸鼠皮下可形成畸胎瘤，具有內(nèi)、中、外三胚層細(xì)胞特征，植入胚泡可形成小鼠胚胎，因此被命名為iPSC[2]。2007年,該小組應(yīng)用相同的轉(zhuǎn)錄因子將人類皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC[3]。iPSC體積小，核/質(zhì)比高，細(xì)胞排列緊密，表達(dá)ESC內(nèi)源性基因Oct4，Sox2，Nanog，Lin28，DPPA4，同時(shí)表達(dá)ESC標(biāo)志性抗原，如腫瘤識(shí)別抗原TRA-1-81、TRA-1-60，階段特異性胚胎抗原SSEA3和SSEA4，其DNA甲基化模式及組蛋白修飾情況與ESC相似。2009年,我國(guó)科學(xué)家利用iPSC通過四倍體囊胚注射技術(shù)得到存活并具有繁殖能力的小鼠，證明iPSC與ESC一樣具有相同的分化潛能[4]。

多能干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)展

自iPSC產(chǎn)生后，誘導(dǎo)技術(shù)不斷改進(jìn)，在誘導(dǎo)因子方面，c-Myc和Klf4與腫瘤發(fā)生相關(guān)， 研究發(fā)現(xiàn)L-Myc較c-Myc誘導(dǎo)效率高，腫瘤形成風(fēng)險(xiǎn)低[5]。2008年，Kim等[6]用Oct4聯(lián)合Klf4或c-Myc將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC;2009年,該研究組僅用Oct4一種轉(zhuǎn)錄因子即將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC[7]。用Oct4,Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)染人類近端腎小管上皮細(xì)胞，13d后可得到iPSC，其上皮細(xì)胞標(biāo)志抗原CD13表達(dá)下調(diào)，腎臟祖細(xì)胞標(biāo)志抗原CD10、CD133、CD24持續(xù)表達(dá)，其他干細(xì)胞基因的表達(dá)與胚胎干細(xì)胞相同[8]。目前認(rèn)為，c-Myc啟動(dòng)了體細(xì)胞重編程，與重編程效率相關(guān)，在體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中，只有Oct4是唯一必需的誘導(dǎo)因子。與普通體細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞誘導(dǎo)效率更高，需要插入的誘導(dǎo)因子少。在誘導(dǎo)載體方面，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率高，但隨機(jī)插入宿主基因存在激活原癌基因風(fēng)險(xiǎn)，目前采用質(zhì)粒[9]、Piggy轉(zhuǎn)座子[10]等非整合型載體同樣可成功誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

iPSC誘導(dǎo)效率低制約其臨床應(yīng)用，最初體細(xì)胞重編程效率僅0.001％～0.01％。抑制或增強(qiáng)某些信號(hào)通路、改變誘導(dǎo)環(huán)境等均可提高誘導(dǎo)效率，如添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑[11]、Wnt信號(hào)通路激活劑[12]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)通路抑制劑[13]、維生素C[14]及骨形態(tài)發(fā)生蛋白[15]等。將iPSC培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度從21％降到5％,誘導(dǎo)效率可提高2.5～4.2倍，進(jìn)一步降低氧濃度到1％,則會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡[16]。在誘導(dǎo)過程中調(diào)節(jié)miRNA-302的水平，增強(qiáng)細(xì)胞整體去甲基化水平，也可提高誘導(dǎo)效率[17]。

腎臟損傷的修復(fù)再生機(jī)制

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腎臟是不可再生的器官，胚胎36周后即無新的腎單位形成[18]。在腎臟包囊壁層上皮細(xì)胞中存在CD133+CD24+腎臟祖細(xì)胞[19]，當(dāng)腎臟損傷時(shí)，MSC、HSC自骨髓歸巢至腎臟，與腎臟祖細(xì)胞及少量停留在G1期的腎小管上皮細(xì)胞一起參與損傷后修復(fù)再生。這些細(xì)胞一方面直接分化為足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等參與修復(fù)，另一方面調(diào)節(jié)炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，γ干擾素(IFN-γ)和抗炎因子IL-10、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、TGF-α和B淋巴細(xì)胞瘤2蛋白(Bcl-2)的分泌來減輕局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎臟再生修復(fù)。在腎臟損傷動(dòng)物模型中，移植外源性干細(xì)胞也可促進(jìn)腎臟修復(fù)。外源性干細(xì)胞可通過尾靜脈、頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈及腎皮質(zhì)局部注射等方式移植至體內(nèi)，治療效果報(bào)道不一，總體來說通過腎動(dòng)脈和腎皮質(zhì)直接注射技術(shù)，干細(xì)胞腎臟歸巢率高，但局部損傷大，通過頸動(dòng)脈、尾靜脈等途徑注射則干細(xì)胞歸巢率低，但易于操作。

iPSC促進(jìn)腎臟再生策略

異體腎臟移植技術(shù)成熟，但供體匱乏。由于腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用自體細(xì)胞進(jìn)行完整器官克隆尚未取得成功。目前臨床上最普遍的是腎功能部分受損，仍殘存有功能的腎單位，對(duì)于這部分患者，研究主要集中在將體外擴(kuò)增的iPSC先定向分化為特定的腎系細(xì)胞，再移植入體內(nèi),在原有腎臟結(jié)構(gòu)中進(jìn)行細(xì)胞和功能修復(fù)(圖2)[20]。

圖2　誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)及分化示意圖[20]

腎系細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC人體絕大多數(shù)體細(xì)胞均可誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，iPSC具有一定的記憶功能,傾向于分化為其最初來源的細(xì)胞[21]，因此將腎系細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，更有利于修復(fù)腎臟損傷。Song等[22]用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4至成年男性腎臟系膜細(xì)胞，12d后這些系膜細(xì)胞與ESC形態(tài)相似，高表達(dá)堿性磷酸酶，并表達(dá)OCT4、腫瘤識(shí)別抗原TRA-1-60、TRA-1-81。將這些未分化的腎臟源性iPSC注入免疫缺陷小鼠中，可形成畸胎瘤。我國(guó)Wang等[23]將載有Oct4,Sox2,c-Myc 和 Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒轉(zhuǎn)染2天齡C57BL/6幼鼠腎小管上皮細(xì)胞，21d后轉(zhuǎn)染成功的腎小管上皮細(xì)胞表現(xiàn)出ESC形態(tài)，并表達(dá)c-Myc、FGF-4、階段特異性胚胎抗原1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因、NANOG、Oct4、Sox2和REX-1，在體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化為內(nèi)、中、外胚層細(xì)胞[23]。獲取腎臟固有細(xì)胞用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞常需要進(jìn)行有創(chuàng)操作，增加了治療難度。Zhou等[24]收集人尿液中脫落的腎小管上皮細(xì)胞，應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)染的方法得到iPSC，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)、誘導(dǎo)效率高及成功率高的優(yōu)點(diǎn)，提示尿液中脫落的腎臟細(xì)胞是iPSC的理想來源。

iPSC向腎系細(xì)胞定向分化腎臟損傷涉及足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞，將iPSC定向分化為特定類型的腎系細(xì)胞，可直接參與修復(fù)腎臟損傷。胚胎期腎臟發(fā)育經(jīng)歷前腎、中腎、后腎三個(gè)階段，后腎由輸尿管芽、生后腎間充質(zhì)組織及基質(zhì)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在一系列誘導(dǎo)信號(hào)分子作用下發(fā)生復(fù)雜的間充質(zhì)細(xì)胞向上皮組織轉(zhuǎn)化。在腎臟發(fā)育過程中，有4個(gè)基因至關(guān)重要，分別是威爾氏瘤抑制基因(WT-1)，Adrenalmarker，Rennin和Kallikrein。WT-1在早期腎臟生成中起核心作用，介導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[25]。腎臟發(fā)育還涉及MYC、活性氧類(ROS)、同源盒基因(HOX)、PAX等基因及表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、TGF-α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)等表達(dá)，在iPSC的分化過程中加入這些調(diào)節(jié)因子，可定向誘導(dǎo)其向特殊腎系細(xì)胞分化。

Song等[26]在培養(yǎng)基中加入激活素A、維甲酸和BMP-7，成功將腎臟系膜細(xì)胞來源的iPSC誘導(dǎo)分化為類足細(xì)胞樣細(xì)胞[26]。這些類足細(xì)胞樣細(xì)胞具有正常足細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)裂隙膜蛋白和突觸極蛋白，并具有增殖潛能。Araoka等[27]應(yīng)用小分子糖原合成酶激酶3抑制劑CHIR99021和維甲酸受體拮抗劑AM580誘導(dǎo)人iPSC分化為中胚層腎源性細(xì)胞，可明顯提高誘導(dǎo)率(達(dá)80％)，同時(shí)縮短誘導(dǎo)時(shí)間至5d。這些中胚層腎源性細(xì)胞可分化為多種腎臟細(xì)胞，并形成腎小管樣結(jié)構(gòu)。Morizane等[28]比較了小鼠ESC和纖維母細(xì)胞來源的iPSC定向分化為腎系細(xì)胞，研究提示iPSC和ESC均可分化為成熟腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞，其中iPSC誘導(dǎo)效率及速度低于ESC，但iPSC具有保持多能性的傾向，激活素具有促進(jìn)ESC和iPSC定向分化為腎小管樣細(xì)胞的作用?？傊琲PSC具有明確的分化為腎系細(xì)胞的潛能，但是由iPSC定向分化為某一種特定的腎臟細(xì)胞目前缺乏統(tǒng)一的誘導(dǎo)分化標(biāo)準(zhǔn)，且分化而來的腎臟細(xì)胞功能與成熟腎臟細(xì)胞相比仍差距。

iPSC在腎臟損傷動(dòng)物模型中的應(yīng)用iPSC對(duì)腎臟急性缺血再灌注損傷及慢性間質(zhì)纖維化均具有修復(fù)再生作用。Lee等[29]將iPSC通過腎內(nèi)動(dòng)脈顯微注射到缺血再灌注急性腎損傷大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，iPSC減輕了腎臟病理?yè)p傷程度，改善腎功能，顯著降低了病死率；該研究還觀察到iPSC具有減輕氧化應(yīng)激、抗炎及抗凋亡效應(yīng)。將常染色體顯性多囊腎病患者體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC，再在這些細(xì)胞中篩選發(fā)生自發(fā)基因修復(fù)的iPSC，用于治療多囊腎病，結(jié)果觀察到攜帶有PKD1+/R+的iPSC的成年嵌合體小鼠中囊腫形成的概率明顯低于攜帶有近親PKD1+/-的iPSC的成年嵌合體小鼠,且與野生型鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[30]。然而目前iPSC治療腎臟疾病研究局限于小樣本觀察性研究，其修復(fù)再生作用尚待進(jìn)一步驗(yàn)證，修復(fù)再生機(jī)制仍不明確。

iPSC免疫原性研究

理論上講，體細(xì)胞來源的iPSC用于自體移植不存在免疫排斥反應(yīng)。然而，目前缺乏統(tǒng)一穩(wěn)定的體細(xì)胞重編程及再分化體系，iPSC在誘導(dǎo)分化過程中其人類組織相容性抗原(HLA)是否會(huì)發(fā)生變化，引發(fā)免疫排斥反應(yīng)尚無定論。2011年《Nature》發(fā)表論文，將C57BL/6鼠成纖維細(xì)胞來源的iPSC與C57BL/6鼠的ESC移植至C57BL/6鼠體內(nèi)，iPSC引發(fā)了免疫排斥反應(yīng)，無法形成正常的畸胎瘤組織，而ESC則未引起免疫排斥，形成了正常的畸胎瘤。通過全基因組表達(dá)譜分析，iPSC形成的不正常的畸胎瘤組織免疫相關(guān)基因Hormad1和Zg16過表達(dá)，導(dǎo)致iPSC免疫原性的改變[31]。2013年《Nature》再次發(fā)表論文，將iPSC定向誘導(dǎo)為皮膚和骨髓組織后再移植至C57BL/6鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示分化后的iPSC中Hormad1和Zg16并無過表達(dá)現(xiàn)象，且未引起免疫排斥反應(yīng)[32]。iPSC自體移植費(fèi)時(shí)費(fèi)力，貽誤治療時(shí)機(jī)，構(gòu)建不同HLA表型的iPSC庫(kù)進(jìn)行異體移植具有廣闊的應(yīng)用前景。

小結(jié)：我國(guó)慢性腎臟病發(fā)病率約10％，迄今仍無有效的方法逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展，iPSC是較為理想的腎臟再生資源。然而iPSC誘導(dǎo)及再分化機(jī)制仍未闡明，缺乏統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范。iPSC誘導(dǎo)過程中涉及轉(zhuǎn)錄因子激活和病毒基因隨機(jī)插入，染色質(zhì)處于不穩(wěn)定狀態(tài)，具有較大致瘤風(fēng)險(xiǎn)，安全性尚無保證。此外，目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中iPSC移植方式及時(shí)機(jī)缺乏高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，已有數(shù)據(jù)局限于小樣本觀察性研究，距離其臨床應(yīng)用還有大量工作需要論證。

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