張婉芬　陳慧梅　張昌明　施少林　劉志紅

原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是臨床常見的腎小球疾病病理類型。國內外的研究均顯示FSGS是引起腎病綜合征及導致終末期腎病(ESRD)的主要病因之一。糖皮質激素是目前治療FSGS的首選藥物，但成人FSGS患者激素治療反應較差，完全緩解(CR)率<30％[1]。FSGS的腎小球局部病變性質不均一，對治療的反應和預后也不相同[2]。目前臨床主要通過治療8周時尿蛋白水平判定疾病的緩解情況，標準單一。對于激素治療反應差的患者，8周后激素無效更換治療方案耽誤了治療的最佳時機。而尿蛋白水平受飲食、尿量、尿中細胞、保存方式等影響較大，且不是一個疾病特異性的標志物。因此，找尋預測FSGS患者激素治療反應，或提前判斷FSGS患者對激素治療反應的標志物具有重要意義。

近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，血液及尿液等多種體液中miRNAs的種類及變化與很多生理及病理過程有關，能作為判斷疾病狀態(tài)的生物標志物[3-5]。我們之前的研究證實尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490的水平與FSGS疾病的活動性呈正相關，大量蛋白尿的FSGS患者尿中miRNAs水平顯著高于緩解的患者[6]。本研究進一步通過回顧性研究和前瞻性研究相結合，分析尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490水平與FSGS激素治療反應的關系，并與傳統(tǒng)的標志物尿蛋白進行比較，判斷尿液miRNAs作為預測治療反應的新型標志物的可能性，從而協(xié)助指導臨床實踐。

對象和方法

實驗設計本研究采用回顧性隊列研究和前瞻性隊列研究兩部分評估m(xù)iR-30a-5p、miR-196a和miR-490對FSGS患者激素治療反應的預測作用。所有患者來自于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科，入選標準包括：(1)經(jīng)臨床與腎活檢確診的原發(fā)性FSGS，排除因其他疾病造成的繼發(fā)性FSGS；(2)所有患者為初治患者，尿蛋白定量>3.5 g/d ；(3)年齡在16～65歲之間；(4)血清肌酐<265.2 μmol/L；(4)無嚴重其他臟器或系統(tǒng)疾病。激素治療效果評定標準：(1)CR組：尿蛋白定量<0.3 g/d，血清肌酐(SCr)水平正常，血清白蛋白水平(Alb)>35 g/L；(2)未完全緩解(non-CR)組包括部分緩解(PR)組和治療無效(NR)組：PR指尿蛋白定量在0.3～3.5 g/d之間，且SCr水平穩(wěn)定(SCr變化<25％)；NR指在接受1 mg/(kg·d)的足量激素治療(最大劑量60 mg/d)16周后患者尿蛋白定量仍>3.5 g/d。

回顧性研究共納入139例FSGS患者，所有患者均接受1 mg/(kg·d)的足量激素治療(最大劑量60 mg/d)8周，若治療8周時患者達CR，則激素逐漸減量，若8周時未達到CR，則足量激素治療延長至16周，此時再次評估患者的治療效果。其中68例患者經(jīng)治療CR，27例PR，44例NR。因PR組例數(shù)較少，故在正式分析時將后兩組合并為non-CR組(71例)。分析治療前尿液miRNAs水平與激素療效的關系。另外共完成了兩項前瞻性隊列研究：一項入選了55例初治的FSGS患者，接受60 mg/d的激素治療8周，治療結束時據(jù)患者蛋白尿的水平評估治療效果，其中33例經(jīng)治療達CR，22例non-CR。比較尿液miRNAs水平在激素治療前后的變化，并比較兩組間變化的差別。另一項研究則入選了22例初治的FSGS患者，接受60 mg/d的激素治療8周，每4周定期隨訪，8周后 11例達到了CR，11例non-CR。觀察兩組miRNAs水平隨治療的變化趨勢及與尿蛋白消長的關系。

入選時詳細記錄所有患者性別、年齡、尿蛋白定量、SCr、總膽固醇(CH)、三酰甘油(TG)等臨床資料。每個隨防點及治療結束時收集尿液，檢測尿液中尿蛋白及miRNAs的水平?；颊叩乃袠吮玖羧《既〉帽救说耐?，經(jīng)倫理委員會批準。

尿液RNA提取方法患者留取隨機尿液樣本，樣本留取后4h內進行處理，1 500 r/min離心10分鐘，留取尿液上清-80℃保存。單個尿液樣本miRNAs提取方法：取300 μl樣品加入到100 μl DEPC水中，充分混勻后加入等體積的酸性酚(PH=4.7～5.5)和氯仿，酸性酚氯仿體積1∶ 1，進行抽提，后續(xù)抽提方法同血清中提取RNA方法一致[3,7]，RNA用10 μl DEPC水溶解，-80 ℃保存。

miRNAs定量PCR檢測(qRT-PCR)采用探針法檢測尿中的miRNAs的含量，探針購于Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)。逆轉錄酶及taq聚合酶購于takara。qRT-PCR采用ABI Prism 7900 定量PCR儀器進行檢測。逆轉錄使用RNA 2 μl，所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR每反應體系使用不稀釋的cDNA 1 μl。尿液miRNAs選用絕對定量的方法計數(shù)[8-10]。

統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析。臨床指標用均數(shù)±標準差表示；臨床指標兩組比較采用t檢驗；miRNAs表達水平的兩組比較采用nonparametric Mann-Whitney U-test檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估m(xù)iRNAs區(qū)分兩治療反應組的價值。

結　　果

尿液miR-30a-5p水平對回顧性隊列FSGS患者激素治療的預測效應在本組研究中，兩組患者治療前性別、年齡，尿蛋白、SCr、CH水平無差異(表1)。qRT-PCR結果顯示，治療前尿液miR-30a-5p水平在未完全緩解組和完全緩解組存在顯著性差異(P=0.03)，而miR-196a和miR-490的水平在兩組之間無顯著性差異(圖1A)。

表1　回顧性研究中FSGS患者臨床指標基線水平

ROC曲線分析顯示，治療前尿液miR-30a-5p的水平能顯著區(qū)分未完全緩解組和完全緩解組，曲線下面積(AUC)為0.628(95％CI 0.536～0.721，P=0.03；圖1B)。而治療前尿液miR-196a和miR-490的水平則不能區(qū)分CR組和non-CR組。這部分研究結果表明，治療前尿液miR-30a-5p的水平在一定程度上具有對FSGS患者激素治療反應的預測作用。

圖1　回顧性研究中完全緩解組和未完全緩解組治療前尿液miRNAs的水平

尿液miR-30a-5p水平預測前瞻性隊列FSGS患者激素治療的反應前瞻性55例初治FSGS患者隊列研究，給予足量激素治療8周，33例患者經(jīng)治療達CR，而22例患者未達到CR，治療前兩組間患者的年齡、性別、尿蛋白定量、SCr、CH的水平無顯著差異(表2)。結果顯示，激素治療CR的33例FSGS患者，尿液miR-30a-5p的表達水平隨著病情的緩解明顯下降(P<0.001)；而激素治療未完全緩解的22例FSGS患者，尿液miR-30a-5p在治療前后沒有明顯的變化(P>0.05)(圖2)。

圖2　FSGS患者治療前后尿液miR-30a-5p的變化

尿液miR-30a-5p對激素治療反應的指示作用先于蛋白尿水平的變化在另一組22例初治的FSGS患者，給予足量激素治療8周后，11例完全緩解，11例未完全緩解，治療前兩組間患者的年齡、性別、尿蛋白的水平無顯著差異(表2)。在治療前(0周)完全緩解組和未完全緩解組的miR-30a-5p水平無明顯差異(P=0.48)，尿蛋白水平無明顯差異(P=0.06)。治療4周、8周時兩組miR-30a-5p水平存在明顯差異(P=0.008；P=0.03)，尿蛋白水平存在明顯差異(P=0.03；P<0.001)，具體見表2。

此外，為避免有個別個體的蛋白尿絕對水平下降顯著，而對整體的絕對蛋白尿水平造成分析上的偏差，選擇用相對于初始的相對蛋白尿水平和相對miR-30-5p水平來分析變化趨勢。以治療前水平作標準化處理后分析，治療4周時相對miR-30a-5p水平在完全緩解組顯著低于未完全緩解組，存在明顯差異(P=0.03)，而此時尿蛋白水平在兩組之間未見明顯差異(P=0.29)。治療在8周時，兩組間的相對miR-30a-5p的水平和尿蛋白水平均存在明顯差異(P=0.003，P<0.001)(圖3)。這部分結果顯示，在完全緩解的患者，miR-30a-5p下降的速度早于蛋白尿的變化，進一步證實了尿液miR-30a-5p水平對FSGS患者激素治療的效果具有預測作用。

表2　前瞻性研究中FSGS患者基線及治療中指標水平

圖3　激素治療過程中CR組和non-CR組尿蛋白和尿液miR-30a-5p水平變化的比較

討　　論

在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)尿液miR-196a、miR-30a-5p和miR-490的水平與FSGS患者疾病的活動性相關，臨床FSGS疾病的活動性根據(jù)尿蛋白水平判斷，因此，本文進一步的究分析尿液miRNAs水平與疾病預后及激素治療效果之間的關系。首先通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，尿液miR-30a-5p治療前的水平能夠區(qū)分CR組和non-CR組，能預測激素治療的反應，而尿液miR-196a和miR-490則不能。再進一步前瞻性的研究發(fā)現(xiàn)，激素治療后FSGS CR組尿液miR-30a-5p的水平較治療前顯著下降，而non-CR組治療前后無顯著差異。最后發(fā)現(xiàn)在CR組，尿液miR-30a-5p的水平不僅隨著激素治療的過程逐漸下降，而且在4周時即可體現(xiàn)出與non-CR組的差別，而此時尿蛋白水平在兩組間無顯著差異。研究結果證實，尿液miR-30a-5p的水平不僅能在治療前預示疾病的預后，而且能反映激素治療的效果，能作為判斷FSGS激素治療和疾病預后的很好的標志物。

既往研究證實，蛋白尿、SCr、治療無效及間質纖維化為成人原發(fā)性FSGS腎臟遠期預后的危險因素[11]。因此在回顧性研究中，F(xiàn)SGS患者均為初治的患者，在完全緩解組和未完全緩解組兩組間初治的蛋白尿水平、SCr水平無顯著性差異，避免了蛋白尿水平、SCr水平差異造成的治療反應的差別。在研究中發(fā)現(xiàn)，同樣是大量蛋白尿的患者，CR組和non-CR組miR-30a-5p的水平在治療前即存在明顯差異，表明尿液miR-30a-5p對激素治療效果具有一定的預測作用，可能是影響FSGS遠期預后的重要因素。miR-30a-5p與miR-196a、miR-490相比，可能在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著更為關鍵的作用。

在前瞻性的研究中，尿液miR-30a-5p的水平隨著疾病的緩解在激素治療后比治療前顯著地降低了；而non-CR的患者，其水平在治療前后無明顯差異。這一結果表明，治療8周時，尿液miR-30a-5p水平的變化與尿蛋白的變化一致，并沒有體現(xiàn)出與尿蛋白的差別。但進一步研究發(fā)現(xiàn)，治療4周相對治療前水平，在CR組和non-CR組尿蛋白水平尚未出現(xiàn)明顯差異時，而尿液miR-30a-5p下降的程度在兩組間已經(jīng)出現(xiàn)明顯的差別，這種變化趨勢與尿蛋白變化存在明顯差別，提示尿液miR-30a-5p的變化快于尿蛋白的變化。臨床通常在治療8周時通過尿蛋白的水平判斷患者激素治療的效果，miR-30a-5p能提前判斷FSGS患者對激素治療的反應，為臨床實踐提供了一個新的方法。

尿液miRNAs和其他體液中的循環(huán)miRNAs一樣，都是在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中由組織、細胞產生的[12,13]。通常細胞內的miRNAs從受損的細胞中被動的漏出或是細胞在受到外界刺激后主動釋放進入循環(huán)中。釋放出的miRNAs被包裹在微囊泡中[14,15]或與高密度脂蛋白結合從而保持在循環(huán)中的穩(wěn)定性[16,17]。miR-196a、miR-30a-5p和miR-490在組織中的表達和作用也從另一方面支持了它們作為FSGS疾病標志物的潛能。miR-30家族在人體腎臟的含量明顯高于心、肺、肝、脾、結腸[18]。之前的研究，包括我們自己的研究發(fā)現(xiàn)[19,20]， miR-30 家族在FSGS患者腎小球的足細胞中顯著表達，其功能的缺失或表達下降可導致足細胞的損傷和凋亡，進一步造成腎小球硬化和蛋白尿的產生；激素治療能夠減輕由轉化生長因子β，脂多糖等刺激因素造成的足細胞中miR-30a家族的下降，激素對miR-30家族的調控作用可能與減少Notch1通路的激活及減輕足細胞損傷有關[19]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前尿液miR-30a-5p的水平CR組高于non-CR組，目前尚不能清楚地闡釋其機制?？赡艿脑蚺c兩組患者本身對激素治療反應不同的原理有關。對于該指標在治療后迅速下降，我們推測，激素治療后，治療有效組足細胞中miR-30a-5p水平得到了維持，減少了足細胞對其主動或被動的釋放，從而尿中miR-30a-5p的水平顯著下降。而治療無效組，由于足細胞損傷未得到很好的修復，足細胞釋放miR-30a-5p的水平未明顯減輕，從而治療結束時下降的水平不如治療有效組。這些研究證實了miR-30家族在FSGS的發(fā)病中起著關鍵的作用，也從側面支持了miR-30a-5p能作為判斷FSGS激素治療效果的標志物。miR-196a在腎臟中表達豐富，但是其在腎臟中的功能還不清楚，研究認為其與病毒免疫、細胞的發(fā)育和分化有關[21,22]。目前還沒有研究證實miR-490在腎臟中的表達與功能。因此盡管之前的研究發(fā)現(xiàn)尿液miR-196a和miR-490的水平隨著疾病的緩解而下降[6]，但是他們在FSGS疾病中的作用與miR-30a-5p可能存在差別。本研究結果提示了不同的miRNAs在FSGS疾病中所存在的差別，但是很難解釋miRNAs在FSGS，特別是miR-30a-5p在疾病發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用，因此，還需要更多體內和體外的研究來進一步幫助我們發(fā)現(xiàn)其中的內在的聯(lián)系與差別。

本研究也存在一些不足之處。首先，我們研究的尿液miRNAs不全面，可能存在其他的miRNAs對疾病的預后有更好的預測作用。另外，如果多個miRNAs的組合，彌補了個體間的差異，比單個miRNAs作為疾病的標志物更有優(yōu)越性[23]。其次，我們在前瞻性研究中選擇的病例較少，因此，影響了對這幾個miRNAs的變化與FSGS激素治療之間的聯(lián)系更深入的討論。盡管研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p對激素治療反應的預測作用，但是沒有提供一個具體的臨界值為臨床診斷服務。因此，進一步探尋FSGS患者miR-30a-5p在尿液中的變化及其調控機制，對于提高FSGS發(fā)病機制的認識和尿液miRNAs的臨床應用具有重要的意義。

總之，尿液miR-30a-5p的水平不僅能在治療前預示激素治療的效果，而且在治療中的變化提前于尿蛋白的變化，并在治療后隨著疾病的緩解而下降，是作為預測FSGS激素治療反應和疾病預后的良好的標志物。

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