王文潔，周聯(lián)東，孫 佩，劉經(jīng)緯，王 蕊

(河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453002)

玉米單倍體加倍方法研究進(jìn)展

王文潔，周聯(lián)東，孫 佩，劉經(jīng)緯，王 蕊

(河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453002)

主要綜述了近年來玉米單倍體加倍方法的最新研究進(jìn)展。自然加倍法和以秋水仙素及除草劑為加倍劑的化學(xué)加倍法是人們研究較多的加倍方法。

玉米單倍體;加倍方法;秋水仙素;除草劑

目前，利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)是獲得玉米單倍體的重要方法，國內(nèi)已有多家育種單位開始應(yīng)用該技術(shù)。采用單倍體育種技術(shù)選育自交系可使材料的純化從常規(guī)育種的5～7年縮短到1～2年，大大提高了育種效率。國外許多公司已實現(xiàn)單倍體育種的規(guī)模化應(yīng)用，但在國內(nèi)單倍體育種還處于初步階段，尤其是誘導(dǎo)獲得的單倍體種子存在加倍率低等問題，限制了國內(nèi)玉米單倍體育種的規(guī)?；_展。為了尋找單倍體高加倍率、操作方便、成本低的加倍方法，許多科研人員進(jìn)行了深入的研究。目前研究較多的加倍方法主要有自然加倍法和和以秋水仙素及除草劑為加倍劑的化學(xué)加倍法。為便于這些方法更好地應(yīng)用于玉米單倍體加倍，筆者對近年來有關(guān)玉米單倍體加倍的方法進(jìn)行了綜述，以期為玉米單倍體育種工作者提供參考。

1 自然加倍法

關(guān)于單倍體的雌雄育性的自然恢復(fù)，劉志增等通過研究發(fā)現(xiàn)，平均有93.2%的單倍體雌穗是自然可育的，雄穗的自然育性較低，散粉株率為5% ～40%不等［1］，但由于單倍體存在雌雄嚴(yán)重失調(diào)，還有一定的空稈存在，導(dǎo)致單倍體的自然加倍結(jié)實率只有10%左右。不同的生態(tài)環(huán)境和基礎(chǔ)材料，單倍體自然加倍結(jié)實率的差異較大。氣候涼爽、晝夜溫差大的環(huán)境有利于單倍體植株的自然加倍;逆境生態(tài)條件(極端高溫、干旱、低溫寡照、瘠薄等)不利于單倍體的自然加倍［1］，因此自然加倍除了與材料特性有關(guān)之外，還與單倍體的種植季節(jié)、種植地點等生態(tài)環(huán)境有很大關(guān)系。

1.1 種植季節(jié)關(guān)于單倍體自然加倍的最佳種植季節(jié)，研究結(jié)論不太一致，多數(shù)研究認(rèn)為在北方春播和三亞冬播有利于單倍體自然加倍。如段民孝等研究發(fā)現(xiàn)，在北京地區(qū)播種的19個材料的單倍體結(jié)實率春播時期明顯高于夏播時期，16個材料的顯花藥率表現(xiàn)為春播時期高于夏播時期，春播和夏播玉米單倍體平均顯花藥率分別為26.9%和19.7%，平均結(jié)實株率分別為3.5%和2.1%，認(rèn)為春播時期更有利于玉米單倍體的自然加倍［2］。劉志增等研究北京春播、北京晚春播、北京夏播、三亞播種對玉米單倍體加倍效果，結(jié)果表明，海南和北京夏播種植玉米單倍體的加倍率較差，并推論單倍體雄穗育性的自然恢復(fù)與生長前期環(huán)境溫度(或晝夜溫差)的變化具有負(fù)(或正)相關(guān)的趨勢［1］。許洛等分別在石家莊春播、石家莊夏播和三亞冬播3種生態(tài)環(huán)境條件下開展了玉米單倍體自然加倍效果的研究，認(rèn)為不同基因型材料間、不同環(huán)境條件下，玉米單倍體自然加倍效果差異明顯，其中三亞冬播效果最好，石家莊春播次之，石家莊夏播不適合單倍體自然加倍［3］。劉德友等通過在山東膠東半島的試驗認(rèn)為夏播有利于單倍體自然散粉及自交結(jié)實。他們發(fā)現(xiàn)，夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交結(jié)實率為6.23% ～9.39%，單倍體自交結(jié)實率夏播比春播高2.37%［4］。蘆連勇等通過在河南安陽進(jìn)行的試驗也認(rèn)為夏播更有利于玉米單倍體的自然加倍。研究發(fā)現(xiàn)，不同材料來源的玉米單倍體夏播和春播的顯花散粉率平均分別為34.24%、29.37%，夏播比春播高4.87個百分點;自交結(jié)實率夏播明顯高于春播［5］。不過，筆者通過在河南新鄉(xiāng)進(jìn)行的單倍體自然加倍試驗，發(fā)現(xiàn)春播比夏播有利于單倍體的自然加倍。春播單倍體生長前期溫度低，溫差較大，應(yīng)該更有利于單倍體的自然加倍。

1.2 種植地點在不同的種植地點，春播和夏播對單倍體的加倍影響不盡相同，這就表明不同地點種植玉米單倍體自然加倍的影響存在明顯差異。如段民孝等認(rèn)為，相比北京春季播種，甘肅春季播種和海南冬季播種比其他地點種植更有利于玉米單倍體自然加倍［6］。蔡泉等認(rèn)為，相同來源的單倍體在海南、黑龍江省的自然加倍率差異顯著，不同來源的玉米單倍體在海南的自然加倍率均高于黑龍江省［7］。

2 化學(xué)加倍方法

2.1 秋水仙素加倍法秋水仙素是一種應(yīng)用最廣泛的化學(xué)加倍試劑，原理是通過阻止細(xì)胞有絲分裂中期紡錘絲微管的收縮而使復(fù)制了的染色體不能移向細(xì)胞的兩極而實現(xiàn)染色體的加倍。它對植物的刺激作用只發(fā)生在細(xì)胞分裂時期，因此通常用來處理的為萌動或剛發(fā)芽的種子、正在膨大的芽及根尖或幼苗、嫩枝的生長點。秋水仙素的適宜濃度和處理時間的長短隨著所處理的器官和處理時的溫度有很大關(guān)系［8］。

選用秋水仙素處理單倍體方法有浸根法、浸芽法和注射法等，不同方法采用的藥劑濃度不同。采用浸芽法處理，操作方法簡單易行，而且具有較高的加倍效率。而當(dāng)用秋水仙素處理玉米芽時，通常采用的濃度為0.05% ～0.06%。如岳堯海等認(rèn)為，秋水仙素濃度、浸芽溫度和浸芽時間對玉米單倍體加倍有明顯的影響，且差異達(dá)極顯著水平;用0.05%秋水仙素和5%二甲基甲砜混合藥劑在15℃下浸泡9 h，單倍體的加倍效果最好，加倍率可達(dá)38.1%［9］。蔡泉等用浸芽法處理單倍體，發(fā)現(xiàn)濃度在0.06%時平均存活率達(dá)到了71.7%，平均加倍率為 21.9%［10］。段民孝等使用 0.06%秋水仙素溶液分別浸泡幼芽上部和幼芽全部，發(fā)現(xiàn)浸泡幼芽上部處理能夠明顯減輕藥害，縮短緩苗時間，提高單倍體植株的加倍效果，成活率、授粉率和結(jié)實株率均是浸泡幼芽全部處理的1.5倍左右，而且浸泡幼芽上部處理的授粉率和結(jié)實率分別是對照的2.0 和4.0 倍以上［11］。

注射法則一般選擇在6葉期注射濃度0.5%的秋水仙素加倍效果最好。如魏俊杰等在單倍體玉米6葉期，分別用濃度為0.1%、0.5%、1.0%秋水仙素 +2.0% 二甲基亞砜(DMSO)混合液2.0 μl注射處理單倍體幼苗莖尖生長點，認(rèn)為在6葉期用注射處理法對玉米單倍體的加倍非常有效，受藥害株數(shù)較少，受藥害株率低，且0.5%秋水仙素濃度處理效果最好［12］。岳堯海等用高誘1號誘導(dǎo)的單倍體植株為材料，在5～6葉期用兩種濃度的秋水仙素配以二甲基亞砜(DMSO)注射處理莖尖生長點，不同基因型材料間有顯著差異，且濃度0.5%秋水仙素的處理效果最好［13］。

2.2 除草劑加倍法由于秋水仙素毒性很大，處理單倍體的濃度和時間掌握不當(dāng)，易導(dǎo)致單倍體成活率低。近幾年來，人們逐漸轉(zhuǎn)向利用除草劑進(jìn)行單倍體加倍的研究，以便可以用除草劑取代秋水仙素用于玉米單倍體加倍。如惠國強等以先玉335、中農(nóng)大4號和8607×8609共3個基因型誘導(dǎo)的單倍體子粒為材料，比較了甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈3種除草劑加倍玉米單倍體的效率。通過滴心法處理單倍體植株3葉期和5葉期幼苗，發(fā)現(xiàn)20～160 pmol/L的3種除草劑對玉米單倍體加倍均有效果，加倍率在3.42% ～26.32%;甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈的加倍率分別為4.29% ～26.32%、3.85% ～20.81% 和 3.42% ～17.61%，其中80 pmol/L甲基胺草磷的加倍效果最佳［14］。張良君等以高誘l號誘導(dǎo)的不同基因型玉米單倍體為材料，在3～5葉期用不同濃度的甲基胺草磷溶液進(jìn)行滴心處理，研究甲基胺草磷加倍單倍體的效果，結(jié)果表明，100 μmol/L甲基胺草磷溶液處理的單倍體加倍效率最高［15］。慈佳賓等用氟樂靈、拿草特兩種抗微管除草劑和秋水仙素在不同處理部位、不同處理時間和濃度條件下對玉米單倍體進(jìn)行單倍體加倍效率研究，結(jié)果表明，3種藥劑用浸種法處理玉米單倍體的加倍率以氟樂靈在濃度80 μmol/L處理20 h最高(35.7%)，用浸芽法處理的加倍率以拿草特在濃度60 μmol/L處理24 h最高(24.8%)，用浸根法處理的加倍率以氟樂靈在濃度40 μmol/L處理 15 h 最高(16.8%)［16］。王賀等以 Mo17 ×PHB1M誘導(dǎo)的單倍體子粒為試驗材料，利用戊炔草胺、甲基胺草磷和秋水仙素為加倍藥劑，浸芽處理單倍體種子，結(jié)果表明，3種藥劑對玉米單倍體加倍均有效果，其中，8 mg/L戊炔草胺、21 mg/L甲基胺草磷、0.7 mg/L秋水仙素浸芽8 h的玉米單倍體加倍率均為各組最高，并認(rèn)為戊炔草胺和甲基胺草磷可以替代秋水仙素加倍玉米單倍體［17］。

3 小結(jié)

單倍體加倍是玉米單倍體育種的制約因素。自然加倍法加倍無毒、無害、無污染、操作簡單，缺點是加倍率較低，一般加倍率高的材料可達(dá)10%左右?；诳蒲腥藛T關(guān)于種植季節(jié)和種植地點對單倍體加倍的影響研究，筆者認(rèn)為單倍體自然加倍可以選擇甘肅春播、海南冬播或者北方地區(qū)春播等進(jìn)行。對于有些自然條件下不容易加倍或者加倍率極低的單倍體材料，可以選擇化學(xué)加倍方法進(jìn)行加倍。利用除草劑等化學(xué)加倍方法進(jìn)行單倍體加倍加倍率最高可達(dá)35.7%。除草劑相對于秋水仙素而言，毒性較低，對材料的毒害較小，因此，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈等除草劑應(yīng)該是玉米單倍體加倍較理想的選擇。選用化學(xué)方法加倍，浸芽法操作方便，更利于玉米單倍體加倍的規(guī)模化。

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Research Progress in Doubling Method of Maize Haploid

WANG Wen-jie et al (Xinxiang Academy of Agricultural Sciences，Xinxiang，Henan 453002)

The recent progress of doubling methods in maize haploid are reviewed.The main methods which included natural doubling and the chemical methods used colchicine，as well as other herbicides are more researched.

Maize haploid;Doubling method;Colchicine;Herbicides

S513

A

0517－6611(2014)25－08542－02

10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.25.025

河南重點科技攻關(guān)項目(122102110007)。

王文潔(1973－)，女，河南新鄉(xiāng)人，副研究員，碩士，從事玉米育種工作。

2014-07-21