張雨祿， 胡三元

(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東濟(jì)南250012)

0 引言

近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因逐漸被認(rèn)識(shí)并且成為研究的熱點(diǎn)．研究認(rèn)為，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在轉(zhuǎn)移腫瘤中呈低表達(dá)，而在非轉(zhuǎn)移腫瘤中呈高表達(dá)，因此認(rèn)為其能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移途徑而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用．乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子(breast cancer metastasis inhibitory factor 1，BRMS1)是2000年新發(fā)現(xiàn)的定位于人11號(hào)染色體的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，已被證明在不同類型的腫瘤中有表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌等，并且能通過抑制腫瘤的遷移、侵襲等抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1－2］．近年，亦有學(xué)者研究BRMS1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，但BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)研究甚少．本文通過分子生物學(xué)方法研究BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)，旨在發(fā)現(xiàn)BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系的受體基因序列，為研究者進(jìn)一步研究BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物學(xué)功能提供依據(jù)，為臨床醫(yī)師從基因?qū)W角度對(duì)人乳腺癌進(jìn)行治療及預(yù)防其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供參考．

1 材料和方法

1．1 材料

細(xì)胞系:人乳腺癌細(xì)胞系:MDA MB-231和MCF-7從歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)購買(ECACC，英國)，在37℃潮濕的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．野生型(MDA231WT，MCF-7WT)細(xì)胞在普通培養(yǎng)液中培養(yǎng):10%胎牛血清(FCS)+ABS(氨芐青霉素，兩性霉素B，鏈霉素)．配比方法:用50 mL的胎牛血清，3．3 g氨芐青霉素，12．5 ng兩性霉素B和5 g鏈霉素，配置在500 mL 0．4%酚紅溶液中．質(zhì)粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)在維持培養(yǎng)液中培養(yǎng)(在普通培養(yǎng)液中加入27．5 μL Blasticidin)．

材料:進(jìn)行PCR所用引物及核酶都是從Sigma-Aldrech公司(英國)購買(引物序列見表1)．PCR混合物從Sigma-Aldrich公司(英國)購買．反轉(zhuǎn)錄試劑盒是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供．除非另有說明，所有其他化學(xué)品均購自Sigma-Aldrich公司．

1．2 方法

1．2．1 轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒(MDA231PEF，MCF-7PEF)被克隆到大腸桿菌中并進(jìn)行重構(gòu)，通過PCR實(shí)驗(yàn)選擇正確的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)并進(jìn)行擴(kuò)增．用基因質(zhì)粒提取試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)進(jìn)行純化．

1．2．2 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄

在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，用TRI反應(yīng)物(T9424-200 ML，Sigma-Aldrich，美國)，按照說明書的參考步驟，對(duì)MDA MB-231和MCF-7細(xì)胞系進(jìn)行RNA提取，然后用分光光度計(jì)(WPA紫外分光光度計(jì)，英國)對(duì)RNA進(jìn)行定量．使用iScript cDNA分析儀(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA．

1．2．3 BRMS1 部分基因敲除實(shí)驗(yàn)

為達(dá)到BRMS1的核酶轉(zhuǎn)基因目的，使用核酶及相應(yīng)PCR引物，通過PCR實(shí)驗(yàn)將BRMS1部分基因敲除，所用引物組為BRMS1rib1F/R．PCR反應(yīng)條件如下:72℃ 10個(gè)循環(huán)，68℃ 10個(gè)循環(huán)，64℃ 10個(gè)循環(huán)，60℃10個(gè)循環(huán)，55℃ 20個(gè)循環(huán)，將PCR產(chǎn)物在大腸桿菌中進(jìn)行克隆與增殖．為了驗(yàn)證正確序列的核酶轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，進(jìn)行了PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，引物組T7F+RBBMR作為陰性對(duì)照組，引物T7F+RBTPF為陽性對(duì)照組(所用引物序列見表1)，通過PCR測(cè)序及克隆分析，對(duì)正確的轉(zhuǎn)基因序列克隆組進(jìn)行擴(kuò)增、純化及提?。畬⒒虿糠智贸腂RMS1重命名為MDA231BRMS1rib1和MCF7BRMS1rib1．

1．2．4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

將MDA MB-231和MCF-7細(xì)胞系的cDNA作為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，所用PCR儀器為T-Cy Thermocycler(AB Applied Biosystems，Thermal Cycler，新加坡)，所用PCR反應(yīng)混合物為Taq Green，2×反應(yīng)混合物．PCR條件如下:94℃、30 s變性過程，55℃、40 s退火過程和72℃、1 min擴(kuò)增過程，分別設(shè)置25、30和35個(gè)循環(huán)．把PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠、100 V電壓下進(jìn)行電泳30 min．用Sybr Safe DNA膠染色劑(Invitrogen，Molecular Probes，美國)染色40 min，最后在一個(gè)超亮LED藍(lán)色顯影儀(Syngene，U:Genius 3)顯示下采集圖片．

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Tab．1 Primers in assays

2 結(jié)果

2．1 BRMS1及其受體在乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表達(dá)

為研究BRMS1及其受體在乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)，進(jìn)行了PCR實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)設(shè)3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)F8/R8對(duì)照組及引物R8/F8和R9/F9組．結(jié)果顯示，BRMS1及其受體在乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中均有表達(dá)，但BRMS1及其受體在引物F9/R9組中的表達(dá)比引物F8/R8組中表達(dá)更強(qiáng)，如圖1所示(PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)．

圖1 BRMS1及其受體在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7的表達(dá)Fig．1 Expression of BRMS1 in human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

2．2 部分基因敲除的BRMS1(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)及其受體在乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)減弱

用PCR實(shí)驗(yàn)研究BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)．結(jié)果顯示，BRMS1部分基因敲除后(MDA231BRMS1rib1，MCF7BRMS1rib1)在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中表達(dá)減弱，見圖2(PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)．

圖2 BRMS1部分基因敲除后在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中表達(dá)減弱Fig．2 Expression of BRMS1 with part genes knocked down was weakened in the human breast cancer cell lines of MDA MB-231 and MCF-7

3 討論

最近的許多研究都集中在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制上，如對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的研究，近幾年報(bào)道，轉(zhuǎn)移抑制基因主要影響腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，而不是影響癌細(xì)胞的增殖［2－3］．乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(BRMS1)就是一個(gè)具有轉(zhuǎn)移抑制活性的因子，BRMS1是轉(zhuǎn)移抑制基因家族中的一個(gè)重要的家庭成員，它能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移但不阻斷腫瘤的生長(zhǎng)［4－5］．研究報(bào)道，BRMS1能明顯降低無胸腺小鼠來自于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移［1，6］，證實(shí)了BRMS1存在于卵巢癌、黑色素瘤及乳腺癌的組織中，并且抑制腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移．研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中，BRMS1的mRNA表達(dá)水平低于原發(fā)腫瘤，并且與相匹配的正常乳腺組織相比，BRMS1在乳腺腫瘤中含量降低［7－10］．盡管BRMS1已被證實(shí)在抑制乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起到一定的作用，但其作用機(jī)制及參與途徑仍不是很明確，BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231及MCF-7中的表達(dá)及其受體仍不是很清楚．因此，發(fā)現(xiàn)BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的受體基因序列，對(duì)于進(jìn)一步研究BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的生物學(xué)功能，以及從基因?qū)W角度對(duì)人乳腺癌進(jìn)行治療及預(yù)防其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有重要意義．

本研究通過PCR實(shí)驗(yàn)方法，從分子生物學(xué)水平上證實(shí)了BRMS1及其受體在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231及MCF-7中均有明顯的表達(dá)，從而發(fā)現(xiàn)BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231及MCF-7中的受體基因序列．從圖1中可以看出，在引物組F8/R8及F9/R9的PCR反應(yīng)中，BRMS1在MDA MB-231及MCF-7細(xì)胞系中均有表達(dá)，但在引物F9/R9的反應(yīng)中表達(dá)增強(qiáng)，提示引物F9/R9所對(duì)應(yīng)的基因序列與BRMS1在MDA MB-231及MCF-7細(xì)胞系中的受體序列吻合度較高．通過酶切反應(yīng)將BRMS1部分基因敲除后，BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)也有相應(yīng)的減弱，如圖2所示，提示核酶BRMS1rib1F/R的基因序列能成功地將BRMS1的部分基因敲除，從而為進(jìn)一步研究BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7的功能試驗(yàn)提供正確的基因序列．

在今后的研究工作中，在發(fā)現(xiàn)BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7中的表達(dá)及其受體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行生物功能試驗(yàn)，研究BRMS1在人乳腺癌細(xì)胞系MDA MB-231和MCF-7的生長(zhǎng)、遷移、侵襲等方面的作用，為乳腺癌的臨床治療提供分子生物學(xué)技術(shù)．通過增強(qiáng)BRMS1在人乳腺癌中的含量及作用，達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的目的，從而減少乳腺癌的轉(zhuǎn)移率，提高患者的長(zhǎng)期生存率．

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