柳學周 劉芝亮, 徐永江 王妍妍 李春廣

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306; 3. 紹興市鴻港農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司 紹興 312000)

生長激素(growth hormone, GH)是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)素, 分子量為21—22 kDa, 對魚類的生長發(fā)育具有重要調(diào)控作用(Chenet al, 1994;Yoweet al, 1995; Benedetet al, 2005)。魚類GH作為新陳代謝的調(diào)控子元件, 能夠有效地促進脂肪更多分解為能源, 使吸收的氨基酸更多用于生長(Yoweet al, 1995), 同時可提高魚類的食欲和餌料中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率(Silversteinet al, 2000), 促進肝糖原的消耗(Leunget al, 1991)和蛋白質(zhì)的合成(Markertet al,1977; Johnssonet al, 1994)。GH在魚體內(nèi)多通路多層次上的綜合調(diào)節(jié), 有效地促進了魚體的生長發(fā)育(Bjornsson, 1997)。研究表明, 體外重組GH與魚體內(nèi)天然GH具有相同的生物活性, 給魚類注射或投喂天然或重組GH可使受體魚食欲增強, 餌料的轉(zhuǎn)化效率提高, 魚體生長加快, 養(yǎng)殖周期縮短, 實現(xiàn)商品魚盡快上市, 從而大大提高養(yǎng)殖效益(Mcleanet al, 1990;簡清等, 1999; 馬進等, 2001; 李晶等, 2004; 孫穎等,2006)。外源GH的生長促進作用可能通過魚類后腸上皮細胞的泡飲作用吸收完整的外源GH蛋白, 從而使得具有免疫學活性和生物學活性的生長激素可以進入魚類血液中, 從而促進魚體生長(簡清等, 1999;孫穎等, 2006)。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevisGünther), 屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus), 為東北亞特有的名貴冷溫性底棲大型鰈形目魚類, 是一種理想的近海增養(yǎng)殖對象(鄧景耀等, 1988), 目前已成為我國三大鲆鰈類主導養(yǎng)殖品種之一。半滑舌鰨具有生長的性別二態(tài)性, 即雌性的生長速度遠大于雄性, 因而養(yǎng)殖雌性苗種更具有經(jīng)濟性。但目前對半滑舌鰨生長調(diào)控機制的認識不足,不利于建立其養(yǎng)殖生長調(diào)控技術(shù)。鑒于GH在魚類生長調(diào)控中的重要作用及其在雌雄個體生長過程中的差異表達特性(Maet al, 2011), 本研究構(gòu)建了半滑舌鰨GH原核表達載體系統(tǒng), 獲得了具有免疫和生物活性的重組半滑舌鰨GH蛋白, 為從蛋白水平深入認識半滑舌鰨生長調(diào)控機制以及開發(fā)實用的半滑舌鰨生長調(diào)控技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

試驗用半滑舌鰨5尾(全長39—48cm, 體重750—1120g)取自青島忠海水產(chǎn)有限公司(青島), 實驗魚運回實驗室后, 以MS222 (280mg/L)麻醉處死, 迅速取其垂體和肝臟組織保存于液氮中(–196°C)用于總RNA提取。

1.2 GH成熟肽的克隆

利用RNAiso plus (TaKaRa)從垂體組織中提取總RNA, 檢驗濃度和純度, 在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)的作用下合成第一鏈cDNA, 保存于–20°C備用。根據(jù)已知半滑舌鰨GH全長序列(GenBank Accession No.: FJ608663)設(shè)計特異性引物, 引物序列見表1。

表1 半滑舌鰨GH成熟肽擴增用特異性引物Tab.1 Primers for matured peptide of GH gene from C.semilaevis

在引物P1和P2的5’端分別加入了HindIII和XhoI酶切位點(方框標注), 同時將下游引物P2終止密碼子TAG更換為強終止密碼子TTA(陰影部分)。為保證重組蛋白翻譯的氨基酸序列的正確性, 在上游引物P1中還額外添加了兩個堿基(下劃線標注)。利用引物P1和P2, 以垂體cDNA為模板PCR擴增得到GH成熟肽, PCR條件: 94°C 5min變性, 然后(94°C 30s, 61°C 30s, 72°C 50s) 34個循環(huán), 最后72°C延伸10min, 將成熟肽片段連接到pEASY-T1載體上, 挑選陽性克隆送往北京華大基因測序驗證。

1.3 原核表達載體的構(gòu)建

選擇測序正確的菌液進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將所得條帶進行切膠回收純化,分別對回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒進行雙酶切, 得到具有相同黏性末端的GH和pET-28a基因片段。

將雙酶切后的GH連接到線性化的pET-28a上,得到重組質(zhì)粒GH/pET28a, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Invitrogen), 菌液PCR驗證并測序。提取測序正確的重組質(zhì)粒, 并制備含GH/pET28a質(zhì)粒的表達菌株BL21(DE3)。

1.4 重組GH/pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達

將含GH/pET28a質(zhì)粒的表達菌株BL21(DE3), 在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6—0.7, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 誘導結(jié)束后, 8000 r/min離心10 min收集菌體, PBS洗滌并重懸菌體, 取20μL重懸后菌體加5μL 5×SDS-PAGE上樣Buffer, 沸水浴5 min, 離心去雜質(zhì),SDS-PAGE電泳檢測是否有GH融合蛋白表達。

將重懸后菌體在37°C擴大培養(yǎng), 至OD600為0.6—0.7時, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 相同條件下繼續(xù)培養(yǎng), 分別在誘導0h、1h、2h、3h、4h、6h后各取2mL菌液, SDS-PAGE電泳檢測, SigmaScan pro 5軟件分析不同誘導時間下融合蛋白表達率。另取部分重組菌分別在18°C、28°C和37°C條件下誘導培養(yǎng)4 h, 分析溫度對融合蛋白表達的影響。

1.5 GH融合蛋白Western-blotting驗證

收集誘導4 h的菌體沉淀和對照菌沉淀, 經(jīng)SDSPAGE電泳后, 利用半干電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 用5% BSA封閉, 室溫下一抗和二抗分別撫育2 h, 所用一抗和二抗分別為6×His Monoclonal Antibody(Clontech)和HRP標記的山羊抗小鼠IgG, HRP-DAB顯色(Tiangen Biotech Co., Ltd), 數(shù)碼相機拍照。

1.6 GH融合蛋白純化和復性

將37°C條件下IPTG (1 mmol/L)誘導表達4 h的重組菌, 8000 r/min 4°C離心10 min, PBS洗滌沉淀,超聲波破碎液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)重懸菌體, 重懸后的菌液于冰浴中進行超聲破碎, SDS-PAGE檢測沉淀和上清。破碎后的沉淀用包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 2 mol/L Urea, 1% Triton X-100)洗滌2—3次, 洗滌后的包涵體溶于包涵體裂解液(6 mol/L guanidine HCl pH 6.5, 0.4 mol/L NaH2PO4, 0.4 mol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl) 4°C過夜變性, 變性后的包涵體12000 r/min離心10 min, 棄沉淀, 上清先后用0.8μm和0.45μm微孔濾膜過濾, 然后Ni2+-NTA親和層析柱(TaKaRa)分離純化融合蛋白。

分離后的融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測后裝入到透析袋中, 分別用8 mol/L→6 mol/L→4 mol/L→2 mol/L尿素梯度復性液和PBS充分透析復性, 用10 kDa超濾管(Millipore)進行超濾濃縮, SDS-PAGE電泳檢測, –80°C超低溫冰箱保存。

1.7 GH融合蛋白的免疫活性測定

將純化并復性后的GH融合蛋白復溶, Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Scientific Co., Ltd)測定重組蛋白濃度。根據(jù)BCA蛋白定量分析試劑盒的測定結(jié)果將GH融合蛋白用ddH2O稀釋106倍, 使稀釋后的估測濃度在Fish GH ELISA Kit (CUSABIO公司, 上海)檢測范圍之內(nèi), 采用競爭酶聯(lián)免疫法檢測GH含量, 按照Fish GH ELISA Kit說明書測定GH融合蛋白濃度。

1.8 GH融合蛋白的生物活性檢測

采用MTT法檢測重組GH蛋白在細胞水平的生物活性。將純化復性的重組蛋白過濾除菌待用。將生長狀態(tài)良好的人乳腺癌細胞MDA231以1×105/mL密度接種于96孔板(每孔200μL), 培養(yǎng)24 h后, 棄去培養(yǎng)基加入含不同濃度重組蛋白(0.49, 2, 4.9和49μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基, 并設(shè)空白對照組, 每組設(shè)4個平行,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后, 棄上清, 每孔加入90μL新鮮培養(yǎng)液, 再加入10μL MTT (Sigma)溶液, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清, 每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)搖床低速震蕩10 min, 使晶體物充分溶解, 酶標檢測儀570 nm波長處讀取各樣品的光密度值。細胞增殖率(GSR)計算方法為: GSR (%control) = Asample / Acontrol×100, Asample為加入重組蛋白組, Acontrol為未加重組蛋白組。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(Means±S.D.)表示, 以SPSS 17.0軟件進行單因素方差(ANOVA)分析, 設(shè)置差異顯著性水平P=0.05, 當P<0.05時視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨GH成熟肽的克隆

RT-PCR擴增腦垂體cDNA后, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測序, 得到與NCBI上相一致的長552bp的半滑舌鰨GH成熟肽序列, 其編碼183個氨基酸, 含四個半胱氨酸(Cys), 可形成兩個二硫鍵, 且在成熟肽兩端酶切位點加入正確, 可用于重組載體構(gòu)建。

2.2 GH/PET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將正確克隆的GH成熟肽序列插入到原核表達質(zhì)粒PET-28a上, 得到重組質(zhì)粒GH/PET28a (圖1),GH/PET28a重組質(zhì)粒編碼重組蛋白的序列(csGH)長681bp, 在T7啟動子的作用下, 由起始密碼子ATG開始編碼重組蛋白, 到終止密碼子TAA停止, 所編碼的GH融合蛋白26 kDa, 等電點為7.77, 由227個氨基酸組成, 其中包括GH成熟肽和N端的6×His標簽, 可進行誘導和蛋白純化。

圖1 GH/pET28a質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmid GH/pET28a

2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達

將重組質(zhì)粒GH/PET28a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導表達, 以未加誘導劑的重組菌為陰性對照。SDS-PAGE電泳顯示, 在20.1 kDa和29 kDa之間出現(xiàn)特異性條帶, 分子大小為26 kDa, 與預期結(jié)果一致(圖2), 說明GH融合蛋白成功表達。

圖2 半滑舌鰨重組GH/pET28a表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein of C.semilaevis

不同溫度誘導條件下獲得的GH融合蛋白表達量不同。由圖3可知, 與18°C和28°C相比, 37°C溫度下蛋白表達量較高, 結(jié)果顯示誘導4 h時GH融合蛋白表達量達到最大(圖2和圖4), 占菌體總蛋白的41.5%, 此后蛋白表達量并不隨時間的延長而增加,可知GH重組菌在37°C條件下以IPTG (1 mmol/L)誘導4 h GH融合蛋白可達到最佳誘導效果。

2.4 IGF-Ⅱ融合蛋白的western-blotting驗證

圖3 不同溫度下重組GH/pET28a表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein at different temperatures

圖4 不同誘導時間下GH融合蛋白的表達量Fig.4 Expression percentage of GH fusion protein in different induction time

采用western-blotting免疫印跡方法對誘導4 h的重組菌進行檢測, DAB顯色后, PVDF膜上在標記位置可見單一清晰印跡(圖5), 說明重組菌表達了融合蛋白, 且能特異性的被6×His抗體識別, 驗證了半滑舌鰨GH融合蛋白表達成功。

圖5 GH融合蛋白的western-blotting驗證Fig.5 Western-blotting analysis on recombinant IGF-I protein

2.5 GH融合蛋白的ELISA測定

通過Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒測得純化后的GH融合蛋白濃度為490μg/mL, 將融合蛋白稀釋106倍后, 采用競爭酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測GH融合蛋白濃度, 結(jié)果顯示重組GH融合蛋白可與魚類生物素標記GH發(fā)生抗體競爭性反應, 測得稀釋后重組GH融合蛋白濃度為502 pg/mL, 與BCA蛋白定量分析試劑盒測定結(jié)果基本一致, 可推斷重組半滑舌鰨GH融合蛋白與其它魚類GH具有相似的免疫活性。

2.6 GH融合蛋白的生物活性檢測

以MTT法來檢測不同濃度的重組GH融合蛋白對MDA231乳腺癌細胞增殖的影響, 結(jié)果如圖6所示。各濃度組重組GH均未見明顯的細胞增殖效果,自2μg/mL開始, 重組GH對細胞生長具有一定的抑制作用, 而以49μg/mL濃度組最為明顯(P<0.01)。

圖6 重組GH融合蛋白生物活性分析Fig.6 Bioactivity of recombinant GH protein of C. semilaevis

3 討論

本研究選擇了大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌,大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、工藝簡單、產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本低等特點, 而且也是目前研究最成熟的表達體系, 大腸桿菌雖缺少蛋白翻譯后的修飾加工機制, 但魚類GH翻譯后無需糖基化修飾, 而且只含有兩個二硫鍵, 容易復性, 因此大腸桿菌是表達魚類GH的理想載體。研究選用pET-28a為表達載體,以T7 RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄, 能轉(zhuǎn)移識別T7強啟動子, 具有比大腸桿菌RNA聚合酶高出數(shù)倍的轉(zhuǎn)錄效率。表達的蛋白為融合蛋白, N-末端含有His-Tag標簽, 便于后期的分離純化。

本研究構(gòu)建的半滑舌鰨GH/pET28a重組質(zhì)粒在原核表達載體BL21(DE3)中成功表達出分子量約26kDa的GH融合蛋白, 融合蛋白表達量較高, 占細菌總蛋白的41.5%。馬騫等(2012)使用pET-32a載體成功表達出了GH融合蛋白, 其在表達系統(tǒng)構(gòu)建過程中未將GH基因信號肽部分切除, 所以表達的GH融合多肽含有半滑舌鰨GH基因的完整ORF序列, 融合蛋白分子量約40kDa, 表達量占細菌總蛋白的37.6%,但未開展融合蛋白純化和活性檢測工作。信號肽的存在對基因的原核表達存在一定的影響(龔婷等, 2009),真核生物的信號肽在原核生物(如大腸桿菌)中表達時大部分不具有分泌功能, 而且始終與活性蛋白融合在一起, 影響活性蛋白的正確折疊與功能發(fā)揮, 因此本研究在構(gòu)建半滑舌鰨GH/pET28a重組質(zhì)粒時, 將GH基因ORF中的信號肽部分切除, 提高了表達水平,將表達產(chǎn)物進行了純化和復性, 并對純化復性后的GH融合蛋白的活性進行了初步研究, 為進一步研究GH蛋白的作用和作用機理奠定了基礎(chǔ)。

純化和復性后的半滑舌鰨GH融合蛋白的ELISA測定結(jié)果顯示其與魚類GH具有相同的抗原活性, 表明體外重組表達的半滑舌鰨GH融合蛋白具有免疫活性。利用細胞增殖試驗驗證其生物學活性時, 發(fā)現(xiàn)重組半滑舌鰨GH蛋白對人乳腺癌細胞MDA231無增殖效果, 而在高濃度才有顯著的細胞生長抑制效果,因此無法斷定其是否具有細胞水平的生物學活性,也同時說明獲得的GH融合蛋白的生長調(diào)控作用不是通過直接作用于細胞實現(xiàn), 可能是通過旁分泌的途徑進行。養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中, 有關(guān)GH的促生長作用,白俊杰等(1999)直接將基因重組的鯉魚GH 添加到飼料中投喂羅非魚, 證實有明顯的促生長作用, Jeh等(1998)將通過大腸桿菌重組表達的牙鲆GH蛋白作為飼料添加劑投喂牙鲆幼苗, 促生長效果明顯。因此,今后本實驗室將繼續(xù)開展重組半滑舌鰨GH融合蛋白對半滑舌鰨幼魚生長調(diào)控作用的相關(guān)實驗, 以驗證體外重組GH融合蛋白對半滑舌鰨的促生長效果。

原核表達系統(tǒng)中目的蛋白的表達量受多種因素影響, 如重組菌濃度、誘導溫度、誘導時間和誘導劑濃度等, 本研究中對對GH融合蛋白的最適誘導溫度和誘導時間進行了探討, 結(jié)果顯示低溫時可產(chǎn)生少量可溶性蛋白, 但融合蛋白含量較低, 純化效果較差,37°C時蛋白表達量最大, 主要以包涵體形式存在, 雖然需要增加復性步驟, 但純化過程較容易, 得到的融合蛋白較多, 為后續(xù)實驗提供了條件。隨著誘導時間的增加, 蛋白表達量逐漸增加, 到達4 h時達到最大,再增加誘導時間蛋白表達量并不隨之增加, 推測其原因可能有兩個方面: 一方面BL21(DE3)雖然為蛋白酶缺陷菌株, 誘導時間過長, 隨著細菌的代謝產(chǎn)物增加, 插入的外源蛋白仍不可避免會遭受宿主的降解, 從而不利于表達蛋白的收獲; 另一方面可能胞體內(nèi)不斷積累的外源蛋白包涵體對宿主菌產(chǎn)生毒素效應, 從而限制了蛋白的積累。

實驗條件下原核表達系統(tǒng)有很多優(yōu)勢, 如工藝簡單、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等, 但將其應用與生產(chǎn)實踐時就體現(xiàn)出很大的局限性, 如需進行蛋白純化和生物活性恢復, 后續(xù)工作比較繁瑣, 在大規(guī)模生產(chǎn)方面酵母表達系統(tǒng)更有優(yōu)勢, 因此半滑舌鰨GH真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建將成為后續(xù)實驗的重點。本實驗結(jié)果為半滑舌鰨GH重組蛋白在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用奠定理論基礎(chǔ)。

馬 進, 白俊杰, 簡 清等, 2001. 重組虹鱒生長激素酵母對羅非魚的促生長作用研究. 大連水產(chǎn)學院學報, 16(3):219—222

馬 騫, 柳淑芳, 莊志猛等, 2012. 半滑舌鰨生長激素及其受體基因的原核表達. 中國水產(chǎn)科學, 19(6): 956—962

鄧景耀, 孟田湘, 任勝民等, 1988. 渤海魚類種類組成及數(shù)量分布. 海洋水產(chǎn)研究, (9): 10—98

白俊杰, 馬 進, 簡 清等, 1999. 鯉魚(Cyprinus carpio)生長激素基因克隆及原核表達. 中國生物化學與分子生物學報, 15(3): 409—412

孫 穎, 林浩然, 2006. 基因重組草魚生長激素(r-gGH)對草魚魚種生長的促進作用. 水產(chǎn)學報, 30(6): 740—746

李 晶, 沙長青, 楊成輝, 2004. 重組鮭魚生長激素基因酵母對鯉魚苗促生長作用研究. 中國飼料, (18): 30—33

龔 婷, 楊孝樸, 李銀聚等, 2009. 雞IL-2全基因和去信號肽基因的原核表達. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報, 44(1): 11—14

簡 清, 白俊杰, 1999. 飼料中添加重組魚生長激素對羅非魚魚種的促生長作用研究. 淡水漁業(yè), 29(3): 3—5

Benedet S, Johansson V, Sweeney Get al, 2005. Cloning of two Atlantic salmon growth hormone receptor isoforms and in vitro ligand-binding response. Fish Physiol Biochem, 31(4):315—329

Bjornsson B T, 1997. The biology of salmon growth hormone:From daylight to dominance. Fish Physiol Biochem, 17(1—6): 9—24

Chen T T, Marsh A, Shamblott Met al, 1994. Structure and evolution of fish growth hormone and insulin-like growth factor genes. Fish Physiology, 13: 179—209

Jeh H S, Kim C H, Lee H Ket al, 1998. Recombinant flounder growth hormone fromEscherichia coli: overexpression,efficient recovery, and growth-promoting effect on juvenile flounder by oral administration. J Biotechnol, 60(3): 183—193

Johnsson J I, Bjornsson B T, 1994. Growth hormone increase growth rate, appetite and dominate in juvenile rainbow trout,Oncorhynchus mykiss. Animal Behavior, 48(1): 177—186

Leung T C, Nga T B, Woob N Y S, 1991. Metabolic effects of bovine growth hormone in the tilapia (Oreochromis mossabicus). Com Biochem Physiol, 99(4): 633—636

Ma Q, Liu S F, Zhuang Z Met al, 2011. Genomic structure,polymorphism and expression analysis of growth hormonereleasing hormone and pituitary adenylate cyclase activating polypeptide genes in the half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis). Genetics and Molecular Research, 10(4): 3828—3846

Markert J R, Higgs D A, Dye H Met al, 1977. Influence of bovine growth hormone on growth rate, appetite and food conversion of yearling coho salmon (Oncorhynchus kisutch)fed two diets of different composition. Journal of Zoology,55(1): 74—83

Mclean E, Meden A C, Donaldson E M, 1990. Intestinal absorption of growth hormone in fish. Fish Biol, 36: 489—496

Silverstein J T, Wolters W R, Shimizu Met al, 2000. Bovine growth hormone treatment of channel catfish: strain and temperature effects on growth, plasma IGF-I levels, feed intake and efficiency and body composition. Aquaculture,190(1—2): 77—88

Yowe D L, Epping R J, 1995. Cloning of the barramundi growth hormone-encoding gene: a comparative analysis of higher and lower vertebrate GH genes. Gene, 162(2): 255—259