張 朋 賀卯蘇 遲長鳳① 王 斌

(1. 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022;2. 浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點(diǎn)工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是一種分子量為15kDa膜結(jié)合糖蛋白, 當(dāng)人體循環(huán)或者局部組織中ACE活性過高, 會促使血管緊張素I (十肽, 由腎素轉(zhuǎn)化而來)的肽鏈C末端的組氨酸和亮氨酸殘基水解形成具有增壓作用的血管緊張素II (八肽), 同時(shí)促進(jìn)具有促血管舒張作用的緩激肽P物質(zhì)的水解, 導(dǎo)致血壓升高。因此, 尋找合適物質(zhì), 抑制體內(nèi)ACE的活性, 即可達(dá)到降低血壓的目的。目前, 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是一類發(fā)展迅速的抗高血壓藥物, 如含巰基(–SH)或硫基(–SR)類的卡托普利(Captopril), 含羧基(–COOH)類的依那普利(Enalapril), 以及含次膦酸基(–POO–)類的福辛普利(Fosinopril)等。此類化學(xué)合成藥物在應(yīng)用過程中常引起患者咳嗽、味覺異常、粒細(xì)胞減少、皮疹、發(fā)熱等不良反應(yīng), 給患者帶來較強(qiáng)的不適感。與化學(xué)合成的ACEI相比較, 通過酶解食源性蛋白質(zhì)獲得的ACE抑制活性肽(ACEP)具有顯著優(yōu)點(diǎn), 主要體現(xiàn)在: (1) 安全性高, 無毒副作用; (2) 原料來源廣, 制備條件溫和, 易于產(chǎn)業(yè)化; (3) 降壓效果專一, 易于消化吸收。因此, 選擇合適的蛋白酶在體外降解蛋白資源, 研究和開發(fā)出具有降血壓作用的活性肽食品或藥物, 成為研究的熱點(diǎn)(Liuet al, 2013)。

目前, 已經(jīng)成功地從多種水產(chǎn)資源中獲得了ACEP。如徐懷德等(2008)利用堿性蛋白酶水解甲魚蛋白獲得具有ACE抑制作用的酶解物, 其對ACE的體外抑制率為99.96%。于婭等(2004)以牡蠣為原料制備的短肽在0.4 mg/mL時(shí)的ACE抑制率為51.4%。戴志遠(yuǎn)等(2009)利用酶解和Sephadex G-50柱層析從河蚌酶解物中得到2個(gè)分子質(zhì)量分別為14.1 (MPP1)和12.7 kDa (MPP2)的組分, 其對ACE抑制作用的IC50分別為0.88和0.32 mg/mL。Fujita等(1999)利用嗜熱菌蛋白酶水解鯉魚得到6種降壓肽, 分別為IY、IKP、LKP、IWH、LKPNM和IWHHT, 均能明顯降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓, ACE抑制活性的IC50值分別為2.31、6.9、0.32、3.5、2.4和5.8μmol/L。Enari等(2008)酶解鮭魚蛋白獲得降壓肽IW, ACE抑制活性檢測顯示其IC50值為1.2μmol/L。Jae等(2004)利用胃蛋白酶酶解鱈魚蛋白, 利用色譜技術(shù)制備降壓肽FGASTRGA, ACE抑制活性檢測顯示其IC50值為14.7μmol/L。Liu等(2013)利用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解水母蛋白, 利用色譜技術(shù)制備降壓肽QPGPT和GDIGY, ACE抑制活性檢測顯示其IC50值分別為80.67和32.56μmol/L。Lee等(2014)利用胰蛋白酶酶解, 色譜制備, 從大馬哈魚魚皮酶解物中制備降壓肽GLPLNLP, ACE抑制活性檢測顯示其IC50值為18.7μmol/L。

金槍魚(Katsuwonus pelamis)是世界遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要作業(yè)魚種之一, 年產(chǎn)量超過600萬噸, 占公海漁業(yè)總產(chǎn)量70%以上(羅紅宇等, 2013; Shyniet al,2014)。在金槍魚加工過程中產(chǎn)生的碎肉、魚頭、魚皮和魚骨等下腳料約占總重量的50%—70%。研究發(fā)現(xiàn)金槍魚碎肉中粗蛋白含量很高, 是良好的蛋白質(zhì)來源(杜帥等, 2013; 譚洪亮等, 2014)。然而, 我國金槍魚下腳料的加工利用不盡如人意, 90%以上仍然作為飼料原料或初級飼料利用, 造成了金槍魚資源的大量浪費(fèi), 也給生態(tài)環(huán)境帶來了較大壓力(杜帥等,2013)。因此, 高效的利用金槍魚下腳料資源具有重要的意義。因此, 本實(shí)驗(yàn)以金槍魚碎肉蛋白為原料進(jìn)行ACEP的研發(fā), 不僅會為高血壓疾病的治療提供候選藥物, 還將為金槍魚下腳料的綜合利用提供一條可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑與儀器

金槍魚(Katsuwonus pelamis)碎肉由寧波豐盛食品有限公司提供。Sephadex G-25購于安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司, 堿性蛋白酶購于上海源聚生物科技有限公司, 色譜純乙腈購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司, 其他試劑為分析純, 購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);U-2800紫外可見分光光度計(jì)(日本日立集團(tuán)); Anke TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠); HD 21C-A核酸蛋白檢測儀(上海康華生化儀器制造有限公司);DS-1高速組織搗碎機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司);SC-15超級恒溫槽(寧波江南儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚碎肉酶解物的制備 稱取金槍魚碎肉100g, 加入pH 10.0的甘氨酸 –NaOH緩沖液500 mL,于組織搗碎機(jī)內(nèi)均質(zhì)5 min, 用1mol/L HCl和NaOH將該混和物調(diào)pH至設(shè)定數(shù)值, 得混和液。將混合液溫度升至預(yù)定溫度攪拌預(yù)熱, 并于攪拌狀態(tài)下保溫20 min; 然后加入預(yù)定量的堿性蛋白酶(酶活力≥1.9×104U/g), 在設(shè)定的時(shí)間下完成酶解之后, 放入95—100°C水浴15 min, 對酶滅活, 滅活液在4°C、4500 r/min離心30 min, 取上清液真空濃縮后冷凍干燥, 得酶解物(TPAP), 并于–20°C低溫保存。

根據(jù)正交試驗(yàn)確定堿性蛋白酶水解金槍魚碎肉蛋白的工藝條件。L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)中酶解條件的因素水平表Tab.1 The factors and levels of enzymatic hydrolysis conditions

1.2.2 D101大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物的脫鹽工藝研究

(1) D101大孔吸附樹脂對TPAP的靜態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn) 取 2.5 g預(yù)先處理的D101大孔樹脂加入到250 mL具塞錐形瓶中, 用無水乙醇充分溶脹樹脂,去離子水洗凈無水乙醇, 再加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的TPAP溶液150mL, 將錐形瓶放入25°C恒溫?fù)u床振蕩12 h, 按照設(shè)定時(shí)間取樣。選擇水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和無水乙醇作為洗脫劑, 對已吸附TPAP并達(dá)到飽和的D101大孔樹脂解吸24 h, 洗脫, 按下式計(jì)算樹脂的吸附率、吸附量和解吸率。

吸附率(%) = [(原液濃度–吸附液濃度)/原液濃度]×100

吸附量(mg/g) = (原液濃度–吸附液濃度)×溶液體積/干樹脂質(zhì)量

解吸率(%) = {(解吸液濃度×解吸液體積)/[(原液濃度–吸附液濃度)×吸附液體積]}×100

(2) D101大孔吸附樹脂對TPAP的動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn) 在室溫條件下, ① 質(zhì)量濃度為10 mg/mL的TPAP分別以0.8 BV/h、1.5 BV/h、3 BV/h的流速經(jīng)過層析柱; ② 質(zhì)量濃度為 5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL的TPAP分別以1.5 BV/h的流速經(jīng)過層析柱, 用紫外檢測流出液的A220, 以A220= 0.05為透過點(diǎn), 比較不同流速和濃度的穿透體積和吸附量。

1.2.3 超濾分級 TPAP用截留分子量為3 kDa和1 kDa的超濾膜超濾分級, 得三個(gè)組分: TPAP-I (MW＞ 3kDa)、TPAP-II (3kDa ＞ MW ＞1kDa)和TPAP-III(MW ＜ 1 kDa)。

1.2.4 Sephadex G-25凝膠過濾層析 取500.0 mg的TPAP-III溶于5 mL雙蒸水中, 加入到預(yù)先平衡的Sephadex G-25凝膠柱(2.6×80cm)上, 用蒸餾水以1 mL/min的速度洗脫, 每5 min收集一管, 并于220 nm檢測吸光度, 按峰合并, 得5個(gè)組分(TPAP-III-1—5)。

1.2.5 TPAP-III-4的反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析 TPAP-III-4經(jīng)RP-HPLC分析為一個(gè)峰。RPHPLC條件為: 色譜柱Zorbax, SB C-18 (4.6×250mm,5μm, Agilent, USA); 流速1 mL/min; 檢測波長220 nm;流動(dòng)相: 乙腈/水梯度洗脫; 柱溫25°C。

1.2.6 ACE抑制率試驗(yàn) 紫外分光光度法參照Cushmand(1971)和經(jīng)Toriki(1993)改進(jìn)的方法檢測金槍魚碎肉蛋白酶解物、超濾分段部位、Sephadex G-25分段部位的ACE抑制率。

量取0.25 mL反應(yīng)液(K3PO4100 mmol/L, pH 8.3;NaCl 300 mmol/L; 馬脲酰組氨酰亮氨酸(HHL)5 mmol/L)加入到試管中, 依次加入1 mL樣品溶液(對照組加雙蒸水), 0.15 mL ACE溶液(5 mmol/L)于反應(yīng)液中, 37°C水浴保溫30 min。加入1 mol/L的HCl 0.25 mL, 充分?jǐn)嚢枰越K止反應(yīng)。加入1.5 mL乙酸乙酯, 充分?jǐn)嚢栎腿》磻?yīng)生成的馬尿酸, 收集上清液。將上清液于100°C水浴加熱約20 min, 以蒸發(fā)掉乙酸乙酯, 然后加入3 mL蒸餾水, 充分振蕩, 228 nm下測其吸光值。根據(jù)各酶解液反應(yīng)值與空白樣品對照, 計(jì)算所得樣品的ACE抑制率。計(jì)算公式為:

式中,A為添加1mL樣品時(shí)的吸光值;Acontrol為1mL蒸餾水代替1mL樣品時(shí)的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 金槍魚碎肉蛋白酶解物的制備工藝研究

影響蛋白酶解效果的因素主要有pH、反應(yīng)溫度、酶和底物濃度比(E/S)、酶解時(shí)間、底物濃度等, 并且不同因素之間還存在交互作用(Pihlanto-lepp?l?, 2001;Ranathungaet al, 2006)。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以pH、酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間為考察因素, 每個(gè)因素各取3個(gè)水平, 并以ACE抑制率為考察指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn), 結(jié)果見表2。

表2 堿性蛋白酶酶解金槍魚碎肉蛋白制備降壓肽的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3, c=10mg/mL)Tab.2 Orthogonal array design matrix L9(34) and experimental results for optimized the enzymolysis conditions of alcalase(n=3, c=10mg/mL)

從極差R值可以看出, 各因素對堿性蛋白酶酶解金槍魚碎肉蛋白的影響程度依次為B＞C＞A＞D, 即酶用量是優(yōu)化條件中影響最大的因素, 酶解時(shí)間的影響最小, 最佳酶解工藝條件為A2B3C2D2, 即pH 9.5,酶用量1.5%, 酶解溫度50°C, 酶解時(shí)間5 h。按A2B3C2D2條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn), 酶解物在10 mg/mL的濃度下的ACE抑制率達(dá)到71.43%±5.19%。

2.2 金槍魚碎肉蛋白酶解物的脫鹽工藝研究

2.2.1 大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物的靜態(tài)吸附能力 D101大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物靜態(tài)的吸附率和吸附量隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖1和圖2所示。結(jié)果表明: 靜態(tài)吸附過程中, 2h內(nèi)的吸附率和吸附量增加非常迅速, 而2h后吸附率和吸附量增加明顯趨緩, 吸附平衡時(shí)的吸附率為88.11%±4.25%, 吸附量為(228.5±8.5)mg/g。

圖1 D101大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物吸附率隨時(shí)間的變化(n=3)Fig.1 Absorption rate of D101 macroporous adsorption resin at varying time (n=3)

圖2 D101大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物吸附量隨時(shí)間的變化(n=3)Fig.2 Absorption capacity of D101 macroporous adsorption resin at varying time (n=3)

2.2.2 D101大孔吸附樹脂對金槍魚碎肉蛋白酶解物的靜態(tài)解析 表3結(jié)果表明: 所選解析液中,水的解吸率最低, 只有15.27%±1.23%; 而乙醇/水的解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增大, 75%乙醇的解吸率可達(dá)到87.44%±3.29%, 但當(dāng)采用無水乙醇時(shí), 解吸率較75%乙醇有所下降, 為82.83%±4.38%。原因可能是部分分子量較大的金槍魚碎肉蛋白酶解物在無水乙醇中溶解性較差, 導(dǎo)致解吸率下降。

表3 不同解吸劑對金槍魚碎肉蛋白酶解物的解吸效果(n=3)Tab.3 Effect of different eluents on desorbing protein hydrolysate of tuna ground meat from D101 macroporous adsorption resin (n=3)

2.2.3 流速對D101大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 流速主要影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散, 從而決定了固定床動(dòng)態(tài)吸附效率。不同流速對D101大孔吸附樹脂的穿透點(diǎn)體積和吸附量影響如表4所示。結(jié)果表明: 酶解物流速從0.8 BV/h、1.5 BV/h增加到3.0 BV/h時(shí), 穿透點(diǎn)體積從(28.33±1.13)mL、(24.57±2.17)mL下降到(19.45±1.36)mL, 減小了31.3%; D101大孔吸附樹脂對酶解物的吸附量也從(7.31±0.41)mg/g、(6.41±0.25)mg/g下降到(4.17±0.32)mg/g, 下降了43.0%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 隨著酶解物流速的增加, 吸附速率也逐漸增大, 穿透點(diǎn)明顯提前, 但D101樹脂對酶解物的吸附量明顯降低。因此, 金槍魚碎肉蛋白酶解物經(jīng)過D101大孔吸附樹脂的流速確定為1.5 BV/h。

表4 不同流速時(shí)金槍魚碎肉蛋白酶解物溶液的穿透點(diǎn)體積和吸附量(n=3)Tab.4 Volume of breakthrough point and adsorption capacity at different flow rates (n=3)

2.2.4 質(zhì)量濃度對大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 金槍魚碎肉蛋白酶解物溶液質(zhì)量濃度(5, 10,20mg/mL)對D101大孔吸附樹脂穿透點(diǎn)體積和吸附量的影響如表5所示: 隨著酶解物質(zhì)量濃度的增加,穿透點(diǎn)體積從(26.75±1.59)mL、(20.47±1.24)mL變化為(15.32±1.08)mL, 說明D101吸附樹脂隨著樣品質(zhì)量濃度的增加, 吸附達(dá)到飽和的時(shí)間逐漸縮短, 樹脂易于達(dá)到飽和。樹脂對高濃度的酶解物具有高的吸附量, 酶解物濃度10mg/mL比5mg/mL時(shí)的吸附量增加了4.10 mg/g; 而20 mg/mL時(shí)的吸附量比10 mg/mL時(shí)增加了2.34 mg/g, 隨著酶解物質(zhì)量濃度的增加, 樹脂的吸附量逐漸達(dá)到最大值。因此, 確定酶解物經(jīng)過D101大孔吸附樹脂的質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

表5 不同質(zhì)量濃度金槍魚碎肉蛋白酶解物溶液的穿透點(diǎn)體積和吸附量(n=3)Tab.5 Volume of breakthrough point and adsorption capacity at different concentrations of protein hydrolysate of tuna ground meat (n=3)

2.2.5 金槍魚碎肉蛋白酶解物脫鹽制備及ACE抑制率 根據(jù)上述結(jié)果, 確定金槍魚碎肉蛋白酶解物脫鹽的工藝條件為: 上樣質(zhì)量濃度10mg/mL、上樣流速1.5 BV/h、解吸劑75%乙醇。在該工藝條件下對金槍魚碎肉蛋白酶解物進(jìn)行脫鹽, 收集的洗脫液經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥后得到酶解物, 得率為65.35%±3.05%。結(jié)果表明, 脫鹽后的金槍魚碎肉蛋白酶解物在10 mg/mL濃度下的ACE抑制活性從71.43%±5.19%增加到81.76%±4.38%, 脫鹽效果良好。

2.3 金槍魚碎肉蛋白酶解物的超濾分級

金槍魚碎肉蛋白酶解物(TPAP)用截留分子量為3 kDa和1 kDa的超濾膜超濾分級, 得三個(gè)組分: TPAP-I(MW ＞ 3kDa)、TPAP-II (3kDa ＞ MW ＞1kDa)和TPAPIII (MW ＜ 1kDa)。如圖3所示: 在5 mg/mL濃度下,TPAP-I、TPAP-II和TPAP-III的ACE抑制率分別為65.38%±3.53%、85.81%%±2.85%和96.33%±3.07%。TPAP-III的活性高于總酶解物及其他超濾分段部位。

圖3 金槍魚碎肉蛋白酶解物及其超濾分級部分的ACE抑制率(n=3)Fig.3 ACE inhibition ratio of TPAP and its fractions by ultrafiltration (n=3)

據(jù)報(bào)道, 蛋白酶解物的生物活性與其分子量具有密切關(guān)系, 小分子量的多肽易于與靶點(diǎn)結(jié)合或通過血腦屏障而發(fā)揮其生物活性(Pihlanto-Lepp?l?, 2001;Ranathungaet al, 2006; Wanget al, 2012)。因此, TPAPIII的高活性與所含大量的低分子量多肽關(guān)系密切。

2.4 TPAP-III的Sephadex G-25凝膠過濾層析

圖4表明: TPAP-III經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾層析后得5個(gè)洗脫組分: TPAP-III-1、TPAP-III-2、TPAP-III-3、TPAP-III-4和TPAP-III-5。5個(gè)組分的ACE抑制率如圖5所示: 在3 mg/mL和5 mg/mL濃度下, TPAP-III-4均顯示出最強(qiáng)的ACE抑制率, 分別為43.4%±1.75%和73.25%±1.83%。

2.5 TPAP-III-4的純度檢測和氨基酸序列分析

圖4 TPAP-III的Sephadex G-25凝膠過濾層析Fig.4 Gel filtration chromatography of TPAP-III on a Sephadex G-15 column

圖5 TPAP-III的Sephadex G-25凝膠過濾層析分段部位的ACE抑制率(n=3)Fig.5 ACE inhibition ratio of fractions from TPAP-III

圖6 TPAP-III-4的RP-HPLC圖Fig.6 RP-HPLC chromatogram of TPAP-III-4

TPAP-III-4經(jīng)RP-HPLC檢測基本為單一峰(圖6),純度達(dá)到氨基酸序列分析的要求。利用Edman降解法經(jīng)蛋白質(zhì)序列分析儀測定TPAP-III-4的序列為Phe-Gly-Gly-Val (FGGV), ESI-MS檢測給出分子離子峰m/z379.50 [M+H]+(圖7), 與理論分子量378.42Da相吻合。

3 結(jié)論

圖7 TPAP-III-4質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrogram of TPAP-III-4

本實(shí)驗(yàn)以ACE抑制率為指標(biāo), 采用堿性蛋白酶從金槍魚碎肉蛋白中制備降壓肽, 極差R分析表明:酶用量是優(yōu)化條件中影響最大的因素, 酶解時(shí)間的影響最小, 最佳酶解工藝條件為: 酶用量1.5%, pH 9.5, 酶解溫度50°C, 酶解時(shí)間5h。利用D101大孔吸附樹脂對酶解物進(jìn)行脫鹽處理的工藝條件為: 上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL、流速1.5 BV/h、解吸劑75%乙醇。

脫鹽酶解物經(jīng)過超濾和凝膠滲透色譜分離純化,得到ACE抑制率較好的單體降壓肽Phe-Gly-Gly-Val(FGGV)。已有的研究證明寡肽相對于蛋白質(zhì)或單一氨基酸具有更強(qiáng)的生物活性和更易在體內(nèi)吸收的優(yōu)點(diǎn)(Wanget al, 2012, 2013; Luoet al, 2013; Chiet al,2014)。Phe-Gly-Gly-Val (FGGV)為四肽化合物, 分子量小, 易于在人體內(nèi)吸收, 從而更容易發(fā)揮較強(qiáng)的降壓功效。另外, Cheung等(2009)發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)的ACE抑制肽C端氨基酸一般為具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)或脯氨酸; N端為長鏈或具支鏈的疏水氨基酸(如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等)或堿性氨基酸可以提高肽的抑制活性。綜上分析可推知, Phe-Gly-Gly-Val (FGGV)具有強(qiáng)的ACE抑制活性是由于其分子量小、含有活性氨基酸及其氨基酸排列順序等因素綜合影響的結(jié)果。

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