盧光遠(yuǎn) 宋秀賢 俞志明

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

氮是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的生源要素, 含氮化合物在微生物酶的作用下發(fā)生著多種生物地球化學(xué)過程(Brandeset al, 2007)。以往的研究者常關(guān)注于海水中以及CO(NH2)2含量的測定, 對微量還原性羥胺等含氮化合物關(guān)注不足。羥胺作為硝酸鹽異化反硝化、厭氧氨氧化和銨鹽第一步硝化作用的中間產(chǎn)物在氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要角色(胡安輝等, 2010; Vajralaet al, 2013),同時在生物代謝中羥胺作為還原態(tài)化合物成為氫的供體(史云峰等, 2007; Brandeset al, 2007)。羥胺具有較強(qiáng)的還原性, 且沒有顯色劑直接與羥胺基團(tuán)形成具有一定特征顯色的物質(zhì)(肖松濤等, 2008), 因此間接測定便成為一種可行之策。目前, 測定羥胺的方法主要有碘量滴定法、電化學(xué)法、光度法、色譜法等(楊明, 1999; 詹國慶等, 2004; Seikeet al, 2004; 孫桂進(jìn)等, 2006; 李京雄等, 2013; Vajralaet al, 2013), 以上方法均因操作繁瑣、顯色時間長、顯色不穩(wěn)定、儀器昂貴等問題未能得到廣泛應(yīng)用。鹽酸羥胺作為還原劑常被用于土壤間隙水、海水、污水等水體中鐵含量的測定(馮媛媛等, 2004; 郝新煥, 2006; 遲光宇等, 2008); 而硫酸鐵銨-鄰菲羅啉法已被用于土壤中羥胺還原酶活性的測定(史云峰等, 2007), 且該法已被證實在復(fù)雜體系中具有較高的準(zhǔn)確度和精密度(楊明, 1999; 史云峰等, 2007), 而在海水中未見羥胺測定的應(yīng)用報道。基于此, 本文應(yīng)用硫酸鐵銨-鄰菲羅啉法測定羥胺還原等量三價鐵離子濃度的原理間接獲得海水中的微量羥胺含量, 對該方法的適用性進(jìn)行了系統(tǒng)檢驗評價, 并測定了天然海水培養(yǎng)東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)藻液中羥胺的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器: T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

試劑: 1.0523g鹽酸羥胺定容至500mL, 配制成濃度為1000mg/L羥胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 于4°C冷藏, 使用前臨時配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。緩沖溶液選取pH值為4.5左右的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液(1mol/L+1mol/L), 氧化劑為硫酸鐵銨(4.0mmol/L), 顯色劑為鄰菲羅啉-乙醇溶液(0.01mol/L)(史云峰等, 2007)。滅菌天然海水(取自匯泉灣, 121°C高溫滅菌20min), 東海原甲藻藻液及0.45μm混合纖維膜過濾液備用。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 實驗原理 弱酸性條件下, 羥胺能將Fe3+還原為Fe2+(公式1), Fe2+與鄰菲羅啉(簡稱phen)生成橙紅色配位化合物(公式2), 此絡(luò)合物較為穩(wěn)定(楊明,1999)?？梢姽庾V510nm處具有較強(qiáng)的吸收峰, 通過測定絡(luò)合物吸光值獲得Fe2+濃度(楊明, 1999), 扣除本底中Fe2+濃度后間接獲得微量羥胺濃度。

1.2.2 工作曲線 分別取10mg/L羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL于100mL容量瓶中, 配制成濃度梯度依次為0.020、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800mg/L的溶液, 取2.5mL至1cm比色皿中, 分別依次加入乙酸鈉-乙酸緩沖溶液、硫酸鐵銨溶液和鄰菲羅啉-乙醇溶液各0.1mL, 混合搖勻顯橙紅色, 30min后在510nm、溫度20oC下測定其吸光值, 每組設(shè)四重樣(史云峰等,2007), 用超純水作參比, 所有數(shù)據(jù)均為扣除空白值。

1.2.3 加標(biāo)回收實驗 取滅菌天然海水2.5mL分別添加0.02、0.10、0.20mL羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液, 每組設(shè)四重樣, 以滅菌天然海水作為空白參比, 其他條件同上, 最后濃度計算時需進(jìn)行體積校準(zhǔn)。

1.2.4 穩(wěn)定性實驗 取滅菌天然海水2.5mL分別添加0、0.10mL羥胺標(biāo)準(zhǔn)使用液, 搖勻顯色后分別在10、30、60、120、180、1080、1440min進(jìn)行測定, 每組設(shè)四重樣。

1.2.5 藻液實驗 分別取已破碎藻液及0.45μm膜過濾藻液2.5mL進(jìn)行以上測定, 每組設(shè)四重樣。

1.3 實驗檢測方法的評價

對間接測定方法進(jìn)行準(zhǔn)確度、檢測限和方法重復(fù)性評價(曹雁平等, 2012)。利用標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等參數(shù)評價方法的精準(zhǔn)度。在進(jìn)行兩組或多組數(shù)據(jù)變異程度比較時, 因為平均值不同, 比較其變異程度不能采用標(biāo)準(zhǔn)偏差, 而要對相對值進(jìn)行比較, 即變異系數(shù)比較, 又稱相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

方法檢測限評價: 通常以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與檢出限附近校正曲線斜率k的商計算檢出限, 即它表示被測組分濃度改變一個單位時分析信號的變化量, 即靈敏度。

方法重復(fù)性評價采用臨界極差法。針對多個測試結(jié)果(n≥2)時, 將結(jié)果極差(測量結(jié)果最大值與最小值之差)與臨界極差CrR0.95(n)進(jìn)行比較,CrR0.95(n)=f(n)Sr, 對于四次平行檢測, 由中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 11792-89中(國家技術(shù)監(jiān)督局, 1989)臨界極差系數(shù)f(n)表查得f(4)=3.6, 任一實驗結(jié)果最大濃度與最小濃度極差小于或等于臨界極差, 則認(rèn)為檢測方法的重復(fù)性較好(李慎安, 2006; 吳孟浩, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥胺工作曲線

實驗結(jié)果表明, 該分光光度間接測定法在羥胺濃度為0.020—0.800mg/L范圍內(nèi), 其濃度與吸光值具有顯著的線性相關(guān)性(y=0.2696x+0.003,R2=0.9996,P＜0.0001,n=32, 圖1)。即使放置24h后吸光值有所升高, 但羥胺濃度與吸光值依然保持顯著的線性相關(guān)性(y=0.3256x+0.0082,R2=0.9951,P＜0.0001,n=32),說明該方法顯色在24h內(nèi)具有較好的線性穩(wěn)定性。顯色30min后吸光值測量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%—5.13%, 平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%; 測量濃度與設(shè)定濃度間的相對誤差為-2.63%—5.71%, 平均相對誤差為1.30%(表1)。

圖1 羥胺溶液工作曲線Fig.1 The working curve of hydroxylamine

表1 羥胺標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的準(zhǔn)確性Tab.1 The accuracy of hydroxylamine in standard solution

2.2 海水加標(biāo)回收試驗

為了解緩沖體系是否適合海水樣品, 分別將海水與緩沖液(乙酸鈉-乙酸)按照50︰1、33.3︰1、25︰1、20︰1、12.5︰1體積比進(jìn)行混合, 測得其pH值依次為4.55、4.51、4.50、4.49、4.48, 再添加硫酸鐵銨后,pH值分別為4.56、4.52、4.50、4.49、4.48。以上結(jié)果說明, 在本研究實驗條件下該反應(yīng)體系pH值較為穩(wěn)定, 適于海水樣品測量。利用添加標(biāo)準(zhǔn)羥胺的溶液與滅菌天然海水為空白進(jìn)行差值比較, 計算添加0.20、1.00、2.00μg羥胺的回收率分別達(dá)到105.9%、108.1%、106.8%, 平均回收率達(dá)到106.9%, 平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%(表2)。該結(jié)果表明, 在滅菌天然海水中添加一定濃度羥胺具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 海水中外加羥胺的回收率Tab.2 The recovery of hydroxylamine added in seawater

2.3 反應(yīng)時間優(yōu)化及穩(wěn)定性試驗

對比滅菌天然海水穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn), 添加標(biāo)準(zhǔn)羥胺溶液不影響顯色時間, 顯色均在30—120min保持穩(wěn)定(P=0.6224＞0.05,n=12), 超過120min會出現(xiàn)吸光值升高現(xiàn)象, 差異性顯著(P＜0.0001,n=24), 這可能是顯色物質(zhì)受到其他微量有色金屬的干擾所致, 而在1440min后吸光度出現(xiàn)較大增長(圖2)。所以, 選擇反應(yīng)時間在30—120min的穩(wěn)定期內(nèi)進(jìn)行測量。顯色干擾在以往研究中時有發(fā)生: 如海水鐵元素測量中銅、鈷、鎳等有色絡(luò)合物離子的共存可能會影響實驗后期的顯色, 而在溶液中添加10倍于羥胺濃度的硝酸銀、亞硝酸銀、氯化銨均對溶液吸光度無影響(楊明, 1999;詹國慶等, 2004; 李京雄等, 2013)。但在乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中, 小于等于10倍鐵濃度的銅、鋅、鈷、鉻及小于2mg/L的鎳不會干擾鐵的測定(郝新煥,2006), 而具有較強(qiáng)還原性的肼可能會對羥胺的測定有一定影響(楊明, 1999; 肖松濤等, 2008)。據(jù)此判斷本研究間接測定法需在120min顯色穩(wěn)定期內(nèi)測定完畢, 以避免其他潛在物質(zhì)的干擾。

圖2 海水及添加羥胺后的反應(yīng)穩(wěn)定性Fig.2 The reaction stability of hydroxylamine in seawater

2.4 藻液中羥胺濃度

將破碎后的東海原甲藻原藻液與0.45μm混合纖維膜過濾后的藻液按照上述方法進(jìn)行羥胺濃度的測定(表3), 發(fā)現(xiàn)過濾后藻液中羥胺的濃度約為0.021mg/L, 接近最低檢測限, 而破碎藻液中羥胺總含量為0.291mg/L (相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.60%), 據(jù)此推測羥胺主要存在于藻細(xì)胞內(nèi)部, 從而驗證了羥胺是在藻細(xì)胞內(nèi)部合成, 是藻細(xì)胞利用銨鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的重要中間體。

表3 東海原甲藻藻液中羥胺濃度Tab.3 Hydroxylamine concentration in Prorocentrumdonghaiense solution

2.5 海水中羥胺分光光度間接檢測方法的評價

利用公式計算該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測樣濃度極差、變異系數(shù)和檢出限(李慎安, 2006; 吳孟浩, 2012),結(jié)果如表4。其中標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr值較低, 由此可確定該方法的精確度較高; 而變異系數(shù)CV值偏低反映出該方法在檢測低濃度羥胺時其離散性較低; 檢出限D(zhuǎn)最低達(dá)0.021mg/L, 相當(dāng)于0.6μmol/L NH2OH, 說明該方法具有較高的分辨率, 但對于痕量級羥胺測定需進(jìn)一步優(yōu)化; 4個實驗的4次平行檢測的最大濃度與最小濃度極差分別為0.0037、0.0111、0.0148、0.0111mg/L, 均小于各自的重復(fù)性臨界極差CrR0.95(n)值0.0067、0.0168、0.0231、0.0168mg/L, 說明該方法的重復(fù)性很好(曹雁平等, 2012)。

表4 間接分光光度檢測羥胺法的評價Tab.4 The evaluating parameters of the indirect hydroxylamine method

本研究只針對同一操作者在不同實驗時間和測樣條件下進(jìn)行的重復(fù)性檢測, 并未針對不同測樣人員和儀器進(jìn)行復(fù)現(xiàn)性檢測(李慎安, 2006)。該方法適于樣品初始pH值在1.5—9.5范圍內(nèi), 由于測試用樣品體積較小, 無法獲知鹽度、溫度等因素對檢測限的影響, 對于海水中更低含量羥胺濃度的測定需要進(jìn)一步優(yōu)化。同時, 針對不同的測量樣品需進(jìn)行特定空白校準(zhǔn)。

3 結(jié)論

海洋生態(tài)系統(tǒng)中, 羥胺可與多種離子發(fā)生氧化還原反應(yīng), 同時可與金屬發(fā)生配位, 在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中會作為化學(xué)誘變劑使堿基對發(fā)生改變, 引起基因突變。所以, 研究羥胺的測定方法不僅對獲得海洋中羥胺的轉(zhuǎn)化過程至關(guān)重要, 更為了解氮的生物地球化學(xué)循環(huán)提供了物質(zhì)佐證。本研究結(jié)果表明: 硫酸鐵銨-鄰菲羅啉分光光度間接法可用于測定海水中濃度范圍在0.020—0.800mg/L的羥胺, 其平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%, 平均相對誤差為1.30%, 通過添加標(biāo)準(zhǔn)物發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性, 測定結(jié)果準(zhǔn)確可信。該方法顯色穩(wěn)定時間在30—120min內(nèi)無顯著差異(P=0.6224＞0.05,n=12)。測定東海原甲藻藻液含量驗證了羥胺在藻細(xì)胞內(nèi)部合成, 是藻細(xì)胞利用銨鹽轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的重要中間體。通過方法不確定度的系統(tǒng)評價得出該方法精確度較高, 檢測時離散性低, 具有較高的分辨率、重復(fù)性, 不需要特殊儀器, 且簡捷易行。

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