邱 艷 商 瑋 趙智明 郭郡浩 蔡 輝 趙凌杰

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，南京 210002)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以全身性多關(guān)節(jié)的滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，它最終會(huì)漸進(jìn)性導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞?；ぱ装Y和骨破壞是兩個(gè)緊密相連的過程，它們是RA患者致殘的主要原因，其致殘率為80%［1］。RA 骨破壞的病理生理機(jī)制并未被完全闡明，骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)和核因子κB 受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)被認(rèn)為參與到RA 的骨重建和骨吸收過程。RA 的治療主要有非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑(TNF-α 阻斷劑、IL-6抑制劑、JAK 激酶抑制劑)等。這些藥物副作用較多，包括胃腸道出血、骨髓抑制、加速骨質(zhì)疏松癥、高血壓、肝毒性、眼毒性、過敏性反應(yīng)，且價(jià)格昂貴以及增加感染及腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。姜黃素(Curcumin，CUR)是從姜科植物姜黃、郁金等根莖中萃取有效單體，化學(xué)結(jié)構(gòu)為C21H2006，具有廣泛的生物學(xué)活性，能夠通過調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路發(fā)生作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等多方面藥理作用［2］。本文通過觀察姜黃素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病理及OPG、RANKL 蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)RA 的作用機(jī)制，為姜黃素治療RA 提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠30 只，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量140～160 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，使用許可證:SYXK20030032(蘇)。

1.2 藥品、試劑與儀器 CUR 溶液:濃度為5 mg/ml(將CUR 500 mg 溶解于無菌的DMSO 10 ml，再加無菌生理鹽水直至100 ml，用5 ml 注射器進(jìn)行分裝，保存需要避光，冰箱溫度調(diào)節(jié)在-20℃，1 周內(nèi)使用完，禁止反復(fù)凍融)。PBS 緩沖液:(將NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 3.63 g、KH2PO40.24 g 溶解于900 ml 的雙蒸水，并將pH 值調(diào)節(jié)至7.2～7.4，定容至1 000 ml，高壓滅菌，室溫保存)。

1.3 方法

1.3.1 分組及造模方法 將大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組:正常組、模型組、姜黃素組，每組10 只。用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，飲水自由，將室溫控制在18℃～26℃之間，濕度調(diào)控在70%左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。參照文獻(xiàn)［3］方法，具體操作如下:除了正常組不造模，將其余2 組大鼠左后跖處進(jìn)行常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射FCA(美國(guó)Sigma 公司)0.1 ml，制成AA 模型，造模當(dāng)天記做第0 天(d 0)。注射FCA 后3～4 h，造模組所有大鼠左后足即可出現(xiàn)紅、腫的炎癥表現(xiàn);d 3 左右達(dá)到高峰;7 d 左右4 只足爪均有不同程度的腫脹，表明造模成功。

1.3.2 給藥方法 模型組、姜黃素組，于7 d 開始腹腔注射給藥。模型組給予10% DMSO(美國(guó)Sunshine 公司)，5 mg/(kg·d)，連續(xù)21 d;姜黃素組給予姜黃素溶液50 mg/(kg·d)，連續(xù)21 d;正常組自由飲水。于最后一次姜黃素治療后24 h，即28 d 用氯胺酮作為麻醉劑，將大鼠仰臥位固定頭部、四肢，剝離膝關(guān)節(jié)滑膜組織，將冰箱溫度調(diào)節(jié)至-80℃保存，利用10%中性甲醛固定液進(jìn)行固定備檢。取左膝關(guān)節(jié)滑膜固定24 h 后，常規(guī)梯度脫水，浸蠟，包埋及切片，切片厚度為4 μm，后行HE 染色，觀察炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況及滑膜組織與纖維組織增生情況;對(duì)右膝關(guān)節(jié)滑膜采用Western blot 法檢測(cè)滑膜RANKL、OPG 蛋白的表達(dá)。

1.3.3 大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理的檢測(cè) HE 染色，參照文獻(xiàn)［4］，具體步驟方法:將滑膜組織固定在10%的中性甲醛溶液固定液(甲醛容量應(yīng)為標(biāo)本體積的2至3 倍)→固定24 h 后→常規(guī)梯度脫水(從低濃度酒精到高濃度酒精逐級(jí)脫水后經(jīng)二甲苯透明)→浸蠟(將切片放入二甲苯浸泡脫蠟，5～10 min/次，2次)→包埋及切片(切片厚度為4 μm)→后行常規(guī)病理HE 染色→蘇木素染色5～10 min，細(xì)胞核著色→自來水沖掉切片上的染色→1%鹽酸乙醇分化5 s→自來水浸洗返藍(lán)→0.5% 的伊紅染色1～3 min，胞質(zhì)著色→逐級(jí)脫水從低濃度到高濃度的酒精→二甲苯脫水、透明→中性樹膠封片→鏡下檢查?；げ±碓u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)［5］:炎性細(xì)胞評(píng)分:0分代表無;1 分代表稀疏，散在;2 分代表較為密集;3分代表大量。纖維組織增生:0 分代表無;1 分代表少量增生;2 分代表中等增生;3 分代表大量增生?；そM織增生:0 分代表無;1 分代表單層;2 分代表2 層;3 分代表3 層。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法 分別測(cè)定OPG、RANKL表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書操作:①蛋白樣本提取制備:胰酶消化滑膜組織→冷PBS 洗滌2 遍→加入200 μl冰水，預(yù)冷裂解緩沖液→混勻后，冰浴30 min→每隔5 min 渦旋震蕩10 s→充分裂解→4℃，13 000 r/min離心10 min →將上清分裝，將冰箱溫度調(diào)節(jié)至-70℃保存?zhèn)錂z;②Western blot:SDS-PAG 的制備:采用5%濃縮膠5 ml［30% Acr/Bis 溶液0.83 ml、1.0 mol/L Tris-HCl (pH6.8)0.63 ml、10% SDS 50 μl、去離子水3.4 ml、10% 過硫酸胺50 μl、TEMED 7 μl］和10% 分離膠10 ml［30%Acr/Bis 溶液3.4 ml，1.5 mol/L Tris-HCl (pH8.8)2.6 ml，10% SDS 100 μl，去離子水3.8 ml，10% 過硫酸胺100 μl，TEMED 7 μl］→將樣本用裂解緩沖液稀釋相同濃度→取等量上樣緩沖液于試管中→蛋白量為70 μg，并于95～100℃5 min 后冰上冷卻上樣→電泳條件為濃縮膠恒壓60V 約20 min→分離膠80V 約80 min→取出凝膠→置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15 min→準(zhǔn)備濾紙及PVDF 膜→分別置入轉(zhuǎn)移緩沖液及去離子水中→平放底部電極(陽極)→在上面分別放置濾紙、PVDF 膜、凝膠和濾紙，排除各層氣泡后將上方電極(陰極)放于夾層物上→按恒流200 mA 通電，電轉(zhuǎn)移1 h→PVDF 膜在封閉液中(5%脫脂奶粉)室溫封閉1 h→棄去封閉液，不洗→按約0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量一抗抗體(OPG 測(cè)定加入OPG一抗，RANKL 測(cè)定加入RANKL 一抗)稀釋度均為(1∶200)→搖床搖蕩孵育(4℃，過夜)→PBST 漂洗濾膜4 次，每次5 min→將膜與HRP 結(jié)合的二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，二抗用封閉液1∶2 000稀釋)室溫下?lián)u蕩孵育1～2 h→用PBST 充分洗膜，漂洗5次，每次5 min→按0.1 ml/cm2顯影液計(jì)算用量→將顯影液加于PVDF 膜上→室溫放置1 min→用保鮮膜將膜包好(盡量避免氣泡)→暗室中迅速將膜蛋白貼在X 光膠片上曝光，洗片機(jī)中顯影、洗像→調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶→試驗(yàn)結(jié)果以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的相對(duì)值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法，若方差不齊則用Tamhane 法。P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠滑膜病理的比較 各組大鼠HE 染色后，光鏡下發(fā)現(xiàn)，正常組滑膜無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，襯里層細(xì)胞大多呈單層，排列規(guī)則，滑膜纖維組織疏松。模型組滑膜出現(xiàn)炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)浸潤(rùn)，襯里層細(xì)胞明顯增厚，滑膜纖維組織增生明顯。姜黃素組存在滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生，其病理改變較模型組減輕(見圖1)。姜黃素組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與模型組比較P=0.000;姜黃素組大鼠纖維細(xì)胞增生與模型組比較P=0.000;姜黃素大鼠滑膜細(xì)胞增生與模型組比較P=0.000;因此，姜黃素組的大鼠滑膜組織病理較模型組顯著改善(P ＜0.01)，見表1。

2.2 3 組大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比較 由表2、圖2 可見，滑膜RANKL 表達(dá)，與正常組大鼠比較，造模組大鼠(模型組、姜黃素組)均顯著升高(P ＜0.01);滑膜OPG，與正常組比較，造模組大鼠組均顯著降低(P ＜0.01)。姜黃素組大鼠滑膜RANKL 表達(dá)與模型組比較P=0.005;姜黃素組大鼠滑膜OPG 表達(dá)與模型組比較P=0.001;RANKL/OPG 比值與模型組比較P=0.000;因此，姜黃素組大鼠的滑膜RANKL 表達(dá)顯著低于模型組，滑膜OPG 表達(dá)顯著高于模型組，RANKL/OPG 比值顯著低于模型組(P ＜0.01)。姜黃素能夠降低RANKL表達(dá)，提高OPG 表達(dá)，改變其比值。

圖1 3 組大鼠滑膜病理的比較Fig.1 Comparisons of synovium pathology among three groups

表1 3 組大鼠滑膜關(guān)節(jié)病理評(píng)價(jià)(±s，n=10)Tab.1 Pathological comparison of synovium among three groups(±s，n=10)

表1 3 組大鼠滑膜關(guān)節(jié)病理評(píng)價(jià)(±s，n=10)Tab.1 Pathological comparison of synovium among three groups(±s，n=10)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal group;2)P ＜0.01，compared with model group.

表2 3 組大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比較(±s，n=10)Tab.2 Comparisons of expression of RANKL，OPG in synovium and the RANKL/OPG ratio among three groups(±s，n=10)

表2 3 組大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比較(±s，n=10)Tab.2 Comparisons of expression of RANKL，OPG in synovium and the RANKL/OPG ratio among three groups(±s，n=10)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal group;2)P ＜0.01，compared with model group.

圖2 3 組大鼠滑膜RANKL/OPG 比值的比較Fig.2 Comparisons of RANKL/OPG ratio in synovium among three groups

3 討論

RA 是一種世界性自身免疫功能障礙性疾病，以滑膜破壞病變?yōu)樘卣鳎瑵u進(jìn)性的侵蝕軟骨和骨，形成骨破壞，最終導(dǎo)致殘疾。本實(shí)驗(yàn)中采用AA 大鼠模型，它是一種用于RA 最具有代表性的動(dòng)物研究模型，AA 大鼠造模方法簡(jiǎn)單，可操作性及重復(fù)性強(qiáng)，在AA 大鼠單側(cè)后肢致敏后，發(fā)生紅、腫、熱、痛，對(duì)側(cè)也會(huì)繼發(fā)性發(fā)生腫脹，且大鼠表現(xiàn)出免疫功能紊亂，AA 大鼠模型造模后存在化膜病變，漸進(jìn)性骨丟失，隨著病程進(jìn)行性加重，病理表現(xiàn)類似于RA［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，AA 大鼠模型，造模后28 d存在滑膜病理改變，炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)浸潤(rùn)，襯里層細(xì)胞明顯增厚，滑膜纖維組織增生明顯;且滑膜RANKL 表達(dá)明顯增加，OPG 的表達(dá)明顯降低。

OPG 是分泌型蛋白，目前發(fā)現(xiàn)OPG mRNA 在骨骼、腎、甲狀腺、腦、肺、心臟、胃腸、脊髓和肝臟均有表達(dá)，但發(fā)生生理功能的部位不一定就是表達(dá)的部位。研究發(fā)現(xiàn)OPG 敲除小鼠，出現(xiàn)B 細(xì)胞成熟障礙，并伴有明顯骨丟失，骨微結(jié)構(gòu)的破壞，表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松易骨折［7］。RANKL 是一種跨膜蛋白，是破骨細(xì)胞形成、融合、分化所必需的細(xì)胞因子，在破骨細(xì)胞介導(dǎo)的RA 骨侵蝕中起著重要的關(guān)鍵作用。骨、骨髓中有高表達(dá)RANKL mRNA，在骨骼具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和保持其活性的功能，是破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的中樞。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 敲除小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨硬化、OC 缺乏、淋巴結(jié)缺乏，在早期T、B 細(xì)胞分化中出現(xiàn)嚴(yán)重的缺陷，胸腺、乳腺發(fā)育缺陷，最終導(dǎo)致小鼠死亡［8］。RANK 屬于Ⅰ型跨膜蛋白，RANK 敲除小鼠出現(xiàn)與RANKL 敲除小鼠相似的表現(xiàn)，因缺乏破骨細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨硬化，淋巴結(jié)缺乏，B、T 細(xì)胞分化缺陷，但胸腺發(fā)育是正常的［9］。在正常的骨重建過程中，RANKL 蛋白結(jié)合RANK，促使破骨細(xì)胞的生成，保持其活性，促進(jìn)骨的吸收功能。當(dāng)骨的吸收大于骨的形成時(shí)，成骨細(xì)胞系自動(dòng)分泌更多的OPG，假性受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RANKL，阻止RANKL 與受體RANK 結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞生成、活化，抑制骨吸收功能，使骨吸收與骨形成又處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

姜黃素具有廣泛的生物學(xué)功能，作用具有多靶點(diǎn)，多通路，具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)T 細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的活性［10，11］。為了進(jìn)一步探討姜黃素對(duì)RA 的治療作用，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，觀察姜黃素對(duì)AA 大鼠滑膜病理及RANKL、OPG 表達(dá)影響。本實(shí)驗(yàn)中觀察到AA 大鼠滑膜病理的影響，姜黃素能明顯改善AA 大鼠滑膜病理學(xué)損傷，減輕滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生等表現(xiàn)。并且在姜黃素治療21 d 后，與模型組比較，滑膜上RANKL 表達(dá)明顯降低，OPG 表達(dá)明顯提高，其比值明顯降低。OPG/RANKL 的比值是最終決定骨質(zhì)變化方向的因素，比率減少，骨質(zhì)則流失增多，比率增大時(shí)，骨質(zhì)則丟失減少。OPG/RANKL 表達(dá)的相對(duì)平衡是RA 是否骨破壞的關(guān)鍵因素，被提議作為反映骨和軟骨的破壞預(yù)測(cè)，來評(píng)估RA 的預(yù)后［12］。由此可見，姜黃素能夠上調(diào)AA 大鼠滑膜OPG 的表達(dá)，下調(diào)滑膜RANKL 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)RANKL/OPG 的比值，參與調(diào)控OPG/RANKL信號(hào)通路，來發(fā)揮對(duì)RA 的治療作用，并改善其預(yù)后。

姜黃素是傳統(tǒng)中藥的有效提取物，具有安全性高，價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。姜黃素不僅能夠改善AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)損傷，還可調(diào)節(jié)滑膜RANKL/OPG 的比值，進(jìn)一步研究姜黃素，為姜黃素用于RA臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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