蔡 力 張 晗 齊淵元 張立麗 黃曉婉 聶 紅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨病變、滑膜細(xì)胞增生為特征的系統(tǒng)性、炎性自身免疫性疾?。?］。RA 的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為是相關(guān)基因、環(huán)境等因素共同作用引起，細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)失衡是其病理發(fā)病過(guò)程的中心環(huán)節(jié)［2］，其中自身反應(yīng)性T 細(xì)胞在RA 發(fā)病過(guò)程中起重要作用［3］。目前RA 藥物治療主要包括非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑、免疫和生物制劑等，但往往治療效果局限或有嚴(yán)重副作用［4］。作為中國(guó)瑰寶，傳統(tǒng)中藥如白芍總苷(Total glucosides of paeony，TGP)已在臨床使用，并且對(duì)RA 具有較好療效。芍藥苷(Paeoniflorin，PF)是白芍總苷的單體提取物，含量超過(guò)90%，與白芍總苷相比具有易溶于水、易量化等特點(diǎn)，同時(shí)也具有擴(kuò)張動(dòng)脈血管、解痙鎮(zhèn)痛、抗炎抗?jié)?、調(diào)節(jié)血糖、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、抗腫瘤等作用［5］。本研究采用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的CIA(Collagen-induced arthritis)小鼠模型，觀察PF 治療CIA 的療效，探討其在自身反應(yīng)性T 細(xì)胞方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)DBA/1J 小鼠(雄性，18～20 g，8～10 周)購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCK(滬)2012-0002］，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部屏障環(huán)境內(nèi)，倫理學(xué)審核編號(hào):2014039。

1.1.2 主要藥物及試劑 牛Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ，CII，Chondrex 公司，USA);完全弗氏佐劑(Complete freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐劑(Incomplete freund’s adjuvant，IFA)(Sigma 公司，USA);冰乙酸(上海試劑四場(chǎng)昆山分廠);芍藥苷(PF，上海一林生物科技有限公司，純度≥95%);Mouse CD4 (L3T4)MicroBeads 和mouse/human CD11b MicroBeads(Miltenyi Biotec 公司，Germany);Anti-mouse CD3 Functional Grade Purified 和Antimouse CD28 Functional Grade Purified(eBioscience，USA);流式熒光抗體Anti-mouse CD4、Anti-mouse IL-17、Anti-mouse IFN-γ、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)(500 ×)(eBioscience，USA);IFN-γ、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(R＆D 公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 CIA 模型建立和分組干預(yù) 用0.05 mol/L冰乙酸溶解CII 至3 mg/ml，4℃攪拌過(guò)夜，次日取CII 與等體積CFA 充分乳化(冰上操作)至油包水狀態(tài)，使膠原濃度為1.5 mg/ml;初次免疫時(shí)，于DBA/1J 小鼠尾根部皮下2～3 cm 處注射100 μl 乳化膠原;第21 天，取CII 與等體積IFA 充分乳化(冰上操作)至油包水狀態(tài)，使膠原濃度為1.5 mg/ml，于相同位置注射50 μl 乳化膠原加強(qiáng)免疫。第21 天，模型小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Vehicle 組，1 × PBS，即Phosphate Buffered Saline，200 μl/d)和治療組(PF組，7.5 mg/kg·d)，腹腔注射，每組8 只，至第46 天處死，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 CIA 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0 分:無(wú)紅腫;1 分:局限的足或踝關(guān)節(jié)輕度紅腫;2 分:關(guān)節(jié)和足趾輕度腫脹;3分:足趾和踝關(guān)節(jié)全部腫脹;4 分:踝關(guān)節(jié)至全爪紅腫或關(guān)節(jié)畸形，每只小鼠四肢評(píng)分相加總評(píng)分為小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

1.2.3 病理學(xué)切片 取小鼠膝關(guān)節(jié)固定、脫鈣、石蠟包埋，常規(guī)切片做蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖 發(fā)病高峰期處死小鼠，取脾臟，用200 目cell strainer 制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液后接種于96 孔圓底板，每組3 復(fù)孔，每孔0.5 ×106個(gè)細(xì)胞，用CII(40 μg/ml)或anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激。細(xì)胞在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，最后16 h 每孔加入0.5 μCi3H-TdR。培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃纖維素膜，讀取cpm 值，檢測(cè)摻入全脾細(xì)胞的3HTdR 量，以評(píng)價(jià)兩組全脾細(xì)胞增殖程度。

CD4 (L3T4)MicroBeads 分選兩組脾臟細(xì)胞的CD4+T 細(xì)胞，接種于96 孔圓底板，每組3 復(fù)孔，每孔0.5 ×106個(gè)細(xì)胞，anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激，用同上方法檢測(cè)摻入CD4+T 細(xì)胞的3H-TdR 量，以評(píng)價(jià)兩組CD4+T 細(xì)胞增殖程度。

CD11b MicroBeads 分選Naive 鼠脾臟中的CD11b+細(xì)胞，按照1∶3比例分別與對(duì)照組和治療組CD4+T 細(xì)胞共培養(yǎng)，每組三復(fù)孔，每孔共0.5 ×106個(gè)細(xì)胞，CII(40 μg/ml)刺激，用同上方法檢測(cè)摻入細(xì)胞的3H-TdR 量，以評(píng)價(jià)兩組共培養(yǎng)體系中T 細(xì)胞增殖程度。

1.2.5 脾臟細(xì)胞中Th1/Th17 細(xì)胞亞群比例 脾臟細(xì)胞接種于96 孔圓底板，每孔0.5 ×106個(gè)細(xì)胞，加入Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500 ×)后在5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，細(xì)胞重懸于100 μl FACS Buffer，首先與FITC-anti-mouse CD4 孵育30 min，F(xiàn)ACS Buffer 洗滌后，按BD 公司Cytofix/Cytoperm Plus kit 說(shuō)明書(shū)破膜固定，與PE-anti-mouse IL-17 和APC-anti-mouse-IFN-γ 孵育30 min，洗滌后加流式緩沖液重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ檢測(cè)分析。

1.2.6 脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子含量 各組脾臟細(xì)胞接種于96 孔圓底板，每組3 復(fù)孔，每孔1.5×106個(gè)細(xì)胞，用CII(40 μg/ml)刺激。細(xì)胞在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集培養(yǎng)上清，ELISA 法檢測(cè)上清中IFN-γ、IL-17 的含量。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷緩解CIA 小鼠臨床癥狀 兩組小鼠在第24 天開(kāi)始發(fā)病，逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)及足趾腫脹和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等癥狀，至第45 天到達(dá)發(fā)病高峰。與對(duì)照組相比，PF 治療組小鼠發(fā)病程度較輕。第39 天開(kāi)始治療組小鼠臨床評(píng)分與對(duì)照組比較具有顯著差異(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1。由此可見(jiàn)，體內(nèi)給予PF 治療可明顯抑制CIA 發(fā)病程度。

圖1 芍藥苷對(duì)CIA 小鼠臨床癥狀的影響Fig.1 Treatment effect of PF on CIA symptoms

2.2 芍藥苷減輕CIA 小鼠關(guān)節(jié)炎癥 發(fā)病高峰期處死小鼠，取膝關(guān)節(jié)做石蠟切片，HE 染色，觀察關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。光鏡下可見(jiàn):與對(duì)照組相比，治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(圖2)。

2.3 芍藥苷抑制CIA 小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞增殖 用3H-TdR 摻入法檢測(cè)兩組小鼠CD3/28 抗體刺激的脾臟單個(gè)核細(xì)胞和CII 特異性單個(gè)核細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示芍藥苷明顯抑制脾臟單個(gè)核細(xì)胞和CII特異性單個(gè)核細(xì)胞增殖。進(jìn)一步用3H-TdR 摻入法檢測(cè)兩組小鼠CD3/28 抗體刺激的CD4+T 細(xì)胞和CII 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示芍藥苷明顯抑制CD3/28 抗體刺激的CD4+T 細(xì)胞和CII 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖(圖3)。相比于CD3/28 抗體刺激，PF 組CII 特異性脾臟單個(gè)核細(xì)胞增殖和CII 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖抑制更為明顯，提示PF可通過(guò)抑制脾臟CII 特異性CD4+T 細(xì)胞的增殖，緩解CIA。

圖2 芍藥苷對(duì)CIA 小鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)影響(×200)Fig.2 Histopathology of knee joints from PBS and PFtreated CIA mice by H＆E staining (×200)

圖3 芍藥苷對(duì)CIA 小鼠脾臟細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of PF on proliferation of splenocytes from CIA mice

2.4 芍藥苷降低CIA 小鼠Th1 和Th17 細(xì)胞亞群比例 CD4+T 細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下分別分化為T(mén)h1、Th2、Th17、Treg 等細(xì)胞亞群，其中Th1 和Th17 細(xì)胞在RA 發(fā)病過(guò)程中起重要作用［6］。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩組小鼠脾臟CD4+T 細(xì)胞中Th1和Th17 細(xì)胞亞群比例。結(jié)果顯示，治療組小鼠Th1和Th17 細(xì)胞亞群比例都明顯低于對(duì)照組(圖4)，提示芍藥苷可能通過(guò)降低Th1 和Th17 細(xì)胞亞群比例緩解CIA 臨床癥狀。

圖4 芍藥苷對(duì)CIA 小鼠Th1 和Th17 亞群比例的影響Fig.4 Effect of PF on Th1 and Th17 subsets in spleens from CIA mice

圖5 芍藥苷對(duì)CIA 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effect of PF on cytokine secretion of splenocytes from CIA mice

2.5 芍藥苷減少CIA 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性細(xì)胞因子分泌 ELISA 法檢測(cè)CIA 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-17 和IFN-γ 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，治療組脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17 和IFN-γ 含量顯著降低(圖5)，提示PF 通過(guò)減少CII 特異性脾臟細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子從而緩解CIA 癥狀。

3 討論

RA 是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯南到y(tǒng)性、炎性自身免疫性疾病，其主要病理表現(xiàn)是:滑膜細(xì)胞過(guò)度增生、微血管新生和血管翳形成，分泌炎性細(xì)胞因子、核因子κB 受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)和抗瓜氨酸蛋白抗體(Antibodies to citrullinated proteins，ACPA)，造成滑膜、軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形影響功能［7］。CIA 是由Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(CFA)免疫基因易感型小鼠建立的RA 模型，它與RA 有相似的病理學(xué)特征:滑膜纖維細(xì)胞增生;單核細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨降解;體內(nèi)可以檢測(cè)到高滴度的Ⅱ型膠原抗體;炎癥后期骨破壞，并導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)畸變［8］。由于大多數(shù)RA 病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中都伴有CD4+T 細(xì)胞活化［9］，提示以CD4+T 細(xì)胞為靶點(diǎn)治療能控制CIA 炎癥反應(yīng)。

TGP 在臨床上已用于治療風(fēng)濕免疫性疾病，其治療RA 的主要作用機(jī)制包括:止疼鎮(zhèn)靜、抗炎抑炎、抑制滑膜增生和血管翳形成、保護(hù)關(guān)節(jié)［5］。作為T(mén)GP 中的主要單體活性成分，PF 因其易溶于水、吸收好、易于劑量標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值［10］。目前已有文獻(xiàn)證實(shí)灌胃給予PF 及其相關(guān)藥物劑型具有緩解大鼠關(guān)節(jié)炎的作用［11］，但其在細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)方面的作用尚無(wú)研究。

本研究表明體內(nèi)注射芍藥苷后CIA 小鼠臨床癥狀明顯緩解。進(jìn)一步檢測(cè)CIA 小鼠脾臟細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠脾臟CII 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖明顯降低，提示芍藥苷能直接抑制CD4+T 細(xì)胞增殖。已有文獻(xiàn)證實(shí)，CD4 缺陷性小鼠CIA 發(fā)病率更低［12］，同樣提示CD4+T 細(xì)胞在CIA 發(fā)病過(guò)程中的重要性?；罨腃D4+T 細(xì)胞可以分化為不同細(xì)胞亞群，其中Th1 和Th17 在CIA病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。與大多數(shù)MHCⅡ基因易感性自身免疫性疾病一樣，CIA 小鼠CII 特異性的CD4+T 細(xì)胞中Th1 和Th17 細(xì)胞亞群比例增高［6，13］。而本研究結(jié)果顯示，芍藥苷治療后CIA 小鼠脾臟細(xì)胞中Th1 和Th17 細(xì)胞比例明顯降低，提示芍藥苷可能通過(guò)抑制致病性Th1 和Th17 細(xì)胞亞群緩解CIA 病情。IFN-γ 是Th1 細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，目前根據(jù)環(huán)境不同其在CIA 病理過(guò)程中起著雙向作用，現(xiàn)認(rèn)為在疾病起始階段體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)較低時(shí)，IFN-γ 起致炎作用，但在疾病晚期，當(dāng)細(xì)胞因子表達(dá)達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，IFN-γ 起抑炎作用［14］。IL-17 是Th17 分泌的特征性促炎細(xì)胞因子，它可以通過(guò)激活T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)RA 病理反應(yīng)［15］，在CII 特異性T 細(xì)胞反應(yīng)起始階段和CII 特異性抗體分泌階段扮演重要角色［16］。已有文獻(xiàn)證實(shí)，IL-17 基因敲除小鼠建立CIA 模型，其發(fā)病明顯減輕［17］，說(shuō)明在CIA 病理過(guò)程中IL-17 發(fā)揮重要作用。芍藥苷治療后發(fā)病高峰期CIA 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ 和IL-17 分泌含量降低，提示其可通過(guò)減少炎性細(xì)胞因子分泌而緩解CIA。

綜上所述，目前研究結(jié)果提示芍藥苷可以通過(guò)作用于CD4+T 細(xì)胞，降低炎性T 細(xì)胞亞群比例和減少炎性細(xì)胞因子分泌而緩解CIA 病情。這為芍藥苷的藥物開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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