魏 晶 陳紀(jì)飛 李 強(qiáng) 安 英 李 芳

(大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，大連 116044)

肺炎克雷白桿菌(Klebsiella pneumoniae，Kp)是一種機(jī)會致病菌，存在于人類的呼吸道、腸道等部位，是較為常見的院內(nèi)機(jī)會致病菌，近年來由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，使該菌耐藥性問題愈加突出，院內(nèi)感染的發(fā)病率也逐年升高，使其成為研究的熱點(diǎn)。建立簡便、經(jīng)濟(jì)、快速及穩(wěn)定的肺炎克雷白菌肺炎動物模型及相關(guān)炎癥因子檢測方法，是深入研究其感染、發(fā)病和耐藥機(jī)制的重要途徑，對治療藥物和治療方法的研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及菌種 C57 小鼠(購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，雌雄各半，6～8 周齡，隨機(jī)分為對照組和模型組，每組10 只。Kp 菌種由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科確認(rèn)并提供。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、RNA 反轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增試劑盒(Prime Script RT-PCR kit)、實(shí)時定量PCR 試劑盒［SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)］及TNF-α 和IL-1β 引物均購自或合成于大連寶生物公司;MPO 測試盒購自南京建成生物公司;全蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司;兔抗鼠TNF-α、IL-1β 多克隆抗體以及羊抗兔IgG 多克隆抗體均購自美國Abcam 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠克雷白桿菌肺炎模型建立 100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(4 ml/kg 體重)，麻醉后仰臥位固定，常規(guī)手術(shù)操作暴露氣管，模型組小鼠氣管內(nèi)注菌(106cfu)20 μl，對照組小鼠注射相同劑量的生理鹽水，切口縫合。術(shù)后24 h，斷髓法處死小鼠，分離肺臟，觀察小鼠肺部炎癥充血情況。

1.2.2 肺組織大體及切片病理學(xué)觀察 取肺組織3～6 mm，甲醛固定3 h 后，轉(zhuǎn)移到70%的酒精中，儲存于-20℃。使用時將組織取出，石蠟包埋，6 μm石蠟切片常規(guī)HE 染色，400 × 光鏡下觀察并拍照。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)動物麻醉后氣管插管，0.6 ml 無菌生理鹽水反復(fù)沖洗肺泡3～4 次。取10 μl 的100 倍稀釋的BALF，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞。

1.2.4 髓過氧化物酶(MPO)分析 取小鼠肺泡灌洗液0.25 ml 和0.1 g 肺組織分別進(jìn)行MPO 活性檢測，分光光度計(jì)460 nm 波長吸光度分析。具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.5 實(shí)時定量PCR 檢測炎癥因子表達(dá) 小鼠肺組織提取RNA，定量及純度鑒定后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說明書進(jìn)行實(shí)時定量PCR 檢測，MX 3000P熒光定量PCR 儀檢測TNF-α 和IL-1β，2-ΔΔCt相對定量方法分析。

1.2.6 Western blot 檢測炎癥因子表達(dá) 肺組織提取總蛋白(按照試劑盒方法操作)，BCA 法測定蛋白濃度后，分別檢測TNF-α 和IL-1β的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 分析軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s 表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 模型組小鼠氣管內(nèi)注菌后，一般狀態(tài)不佳，3 h 左右開始出現(xiàn)喘息、寒顫、食欲不振以及豎毛等表現(xiàn);對照組小鼠僅出現(xiàn)食欲不振的表現(xiàn)。24 h 后，對照組小鼠狀態(tài)基本恢復(fù)，而模型組小鼠一般狀態(tài)仍不及對照組。

2.2 肺組織大體觀察 對照組小鼠肺組織顏色紅潤、紋理清晰、質(zhì)地柔軟，無組織充血水腫現(xiàn)象。而對照組小鼠肺組織表現(xiàn)為嚴(yán)重的組織充血及水腫、顏色變深、質(zhì)地變硬且組織紋理不明顯(圖1)。

2.3 組織切片及病理學(xué)觀察 HE 染色后組織學(xué)觀察，對照組肺組織均勻，少見肺泡融合及炎性細(xì)胞浸潤(圖2A);模型組有明顯的組織融合，肺泡壁增厚，肺泡腔界限不清，很少見到正常肺泡結(jié)構(gòu)，可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，且以中性粒細(xì)胞為主(圖2B)。

2.4 BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 模型組肺灌洗液中性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組(P ＜0.05)(圖3)。

2.5 髓過氧化物酶(MPO)活性測定 通過髓過氧化物酶(MPO)活性試驗(yàn)，間接反映中性粒細(xì)胞在肺組織中浸潤程度。結(jié)果顯示肺組織(圖4A)和BALF 中(圖4B)MPO 釋放量模型組明顯高于對照組。

2.6 實(shí)時定量PCR 檢測炎癥因子 經(jīng)MX 3000P熒光定量PCR 儀分析得到各組樣本的Ct 值，各組Ct 值利用2-ΔΔCt方法得到相對定量結(jié)果(圖5)。

2.7 Western blot 檢測炎癥因子表達(dá) 模型組TNFα 和IL-1β 表達(dá)均高于對照組(圖6)。

圖1 肺組織大體觀察Fig.1 Gross observation of lung tissues

圖2 正常組(A)和模型組(B)HE 染色結(jié)果(×400)Fig.2 HE stainning results of normal group(A)and Kp group(B)(×400)

圖3 正常組和模型組BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.3 The numbers of neutrophils in BALF in normal and Kp groups

圖4 肺組織及BALF MPO 檢測Fig.4 MPO detections in lung tissues and BALF

圖5 實(shí)時定量PCR 結(jié)果Fig.5 Result of real-time PCR

圖6 IL-1β(A)及TNF-α(B)表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of IL-1β(A)and TNF-α(B)

3 討論

Kp 是兼性厭氧的革蘭陰性桿菌，在正常人口咽部的帶菌率為1%～6%［1］，在住院患者中攜帶率更高。20 余年來，該菌已成為院內(nèi)獲得性肺炎的主要致病菌，耐藥株不斷增加，且有耐藥性不斷增高的趨勢，因此研究如何有效預(yù)防和治療該菌感染顯得十分重要。本文利用氣管內(nèi)注菌的方法建立克雷伯桿菌肺炎動物模型，該模型可用于研究機(jī)體針對Kp的防御和清除機(jī)制［2，3］，也可用于耐藥機(jī)制或治療方法的研究，如細(xì)胞因子及其受體拮抗劑在該病治療中的作用［4］。在實(shí)驗(yàn)中，通過HE 染色的肺組織切片以及BALF 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)可以表明模型組有大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞滲出，并且明顯高于對照組;MPO，作為一種標(biāo)志性的中性粒細(xì)胞胞漿抗原，可以間接的反映中性粒細(xì)胞的滲出以及活性狀況，在實(shí)驗(yàn)中，無論是BALF 還是肺組織，模型組中MPO 的活性都明顯高于對照組，這說明在Kp作用下，小鼠肺部確實(shí)產(chǎn)生了以中性粒細(xì)胞滲出為主的炎癥反應(yīng)。有研究表明［5-7］，在肺組織中引起中性粒細(xì)胞聚集增多的細(xì)胞因子主要是TNF-α 和IL-1 β，實(shí)時定量PCR、Western blot 的結(jié)果也都表明，模型組細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的合成和釋放都要明顯高于對照組，另外實(shí)時定量PCR 也表明，和對照組相比，模型組TNF-α、NF-κb、IFN、IL-6、IL-1β、KC 等明顯升高，表明細(xì)胞因子合成和釋放與炎癥發(fā)生發(fā)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此通過藥物抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及釋放可作為重要的研究方向［8，9］。該試驗(yàn)為研究克雷白桿菌肺炎的損傷機(jī)制以及抗炎藥物的開發(fā)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)動物模型。

［1］李紅林，盧月梅，吳勁松，等.肺炎克雷白桿菌耐藥性分析［J］.白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，20 (7):84-85.

［2］Happel KI，Dubin PJ，Zheng M，et al.Divergent roles of IL-23 and IL-12 in host defense against Klebsiella pneumoniae［J］.J Exp Med，2005，202(6):761-769.

［3］Happel KI，Zheng M，Young E，et al.Cutting edge:roles of Tolllike receptor 4 and IL-23 in IL-17 expression in response to Klebsiella pneumoniae infection［J］.J Immunol，2003，170(9):4432-4436.

［4］魏 晶，李 偉，邵萬平，等.CXCR1/CXCR2 拮抗劑G31P 抗中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥作用研究［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010，30(5):483-486.

［5］Guglielmotti A，Aquilini L，Rosignoli MT，et al.Benzydamine protection in a mouse model of endotoxemia［J］.Inflamm Res，1997，46(9):332-335.

［6］Johnston CJ，F(xiàn)inkelstein JN，Gelein R，et al.Pulmonary cytokine and chemokine mRNA levels after inhalation of lipopolysaccharide in C57BL/6 mice［J］.Toxicol Sci，1998，46(2):300-307.

［7］Mizgerd JP.Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs［J］.Sem in Immunol，2002，14(2):123-132.

［8］Ionita MG，Arslan F，de Kleijn DP，et al.Endogenous inflammatory molecules engage Toll-like receptors in cardiovascular disease［J］.J Innate Immun，2010，2(4):307.

［9］Drexler SK，F(xiàn)oxwell BM.The role of toll-like receptors in chronic inflammation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42 (4):506-518.