崔倩 李潔 劉曉光

（天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院 天津 300457）

根癌農(nóng)桿菌介導的赭曲霉遺傳轉化體系的建立

崔倩 李潔 劉曉光

（天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院 天津 300457）

赭曲霉在工業(yè)上用于甾體C-11α羥基化。為了對現(xiàn)有赭曲霉生產(chǎn)菌株進行遺傳改造，以農(nóng)桿菌LBA4404作為侵染菌株，以赭曲霉（TCCC41060）作為受體菌株，以潮霉素B基因作為篩選標記，成功建立了根癌農(nóng)桿菌介導的赭曲霉遺傳轉化體系并對其轉化效率的主要影響因素，如農(nóng)桿菌濃度、孢子濃度、共培養(yǎng)時間和溫度等進行了分析。在最佳條件下，轉化效率可以達到57個轉化子/108個分生孢子。隨機挑選的8個陽性轉化子10代連續(xù)培養(yǎng)結果表明所獲得的轉化子能穩(wěn)定遺傳。該遺傳轉化體系的建立為赭曲霉菌株的定向遺傳改造提供了重要的操作平臺。

赭曲霉 根癌農(nóng)桿菌 轉化體系

赭曲霉（Aspergillus ochraceus），屬于殼霉目，杯霉科，在自然界中分布廣泛。目前工業(yè)上主要應用赭曲霉進行甾體類藥物的C-11α羥基化反應，如制備心血管藥物C-11α羥基化坎利酮［1］。若要進一步提高赭曲霉對甾體類藥物的催化效率，需要從發(fā)酵條件優(yōu)化和菌株改造兩個方面進行研究。到目前為止，有關赭曲霉催化甾體類藥物發(fā)酵條件優(yōu)化的研究已有不少，但是對赭曲霉菌株的定向改造報道并不多，僅有學者報道通過原生質(zhì)體轉化法敲除了赭曲霉中合成赭曲霉毒素A的pks基因［2］。本研究意在建立一個高效的赭曲霉遺傳轉化體系，從而為生產(chǎn)菌株的定向遺傳改造奠定基礎。

目前已報道的絲狀真菌的DNA轉化方法主要有CaCl2/PEG轉化法［3，4］、電擊轉化法［3，5］、基因槍轉化法［3，6］、限制性內(nèi)切酶介導的轉化法［7，8］、農(nóng)桿菌介導轉化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）［9］。綜合來看，CaCl2/PEG轉化法具有原生質(zhì)體的制備過程繁瑣、穩(wěn)定性較差、

再生頻率較低等缺陷［4］；電擊轉化法和基因槍轉化法同時具有需要特別儀器設備和轉化效率低的缺點［3］；限制性內(nèi)切酶介導的轉化法所獲得的突變子中很大比例的突變?yōu)榉菢擞浲蛔?，這為基因克隆和分析帶來很大困難［4］；而農(nóng)桿菌介導轉化法具有較高的轉化效率、轉化子的穩(wěn)定性較高，并且操作簡單等優(yōu)點［10-12］。

目前，農(nóng)桿菌介導轉化的方法已經(jīng)成功實現(xiàn)了對多種絲狀真菌的遺傳轉化。例如，日本曲霉［13］、泡盛曲霉［14］、黑曲霉［15］及煙曲霉［16］等。本研究利用農(nóng)桿菌LBA4404成功構建了赭曲霉的農(nóng)桿菌轉化體系，并對影響其轉化效率的主要因素進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 赭曲霉TCCC41060、根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、質(zhì)粒pPZP-HYG和質(zhì)粒pCSN44均為本研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基［17］用于培養(yǎng)大腸桿菌；土豆培養(yǎng)基（PDA）［17］用于培養(yǎng)赭曲霉；YEB培養(yǎng)基［17］用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌；IM培養(yǎng)基［13］用于對農(nóng)桿菌進行誘導和介導轉化過程的共培養(yǎng)。

1.1.3 試劑、抗生素和引物 各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker等購自 TaKaRa 公司；乙酰丁香酮（AS）2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸鈉鹽（MES）購自Sigma試劑公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、DNA 純化回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

潮霉素B購自北京索來寶科技有限公司；卡那霉素和頭孢霉素購自購自 TaKaRa 公司。

檢測潮霉素抗性基因的引物為HYG-F-（5'-GACATCGACACCAACGATC-3'），HYG-R-（5'-GACTCTTATTAGCAGACAGG-3'）由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建 用XhoI和Hind III將潮霉素B基因片段從質(zhì)粒pCSN44上切下，同時用同樣的酶切位點將質(zhì)粒pPZP-HYG上的6.5 kb片段切下，構建重組質(zhì)粒pPZP-hph。并將其轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上挑選陽性轉化子。提取質(zhì)粒后進行酶切和PCR驗證，獲得正確的重組載體pPZP-hph。

1.2.2 潮霉素B對赭曲霉最小抑制濃度的確定 用無菌水將培養(yǎng)5 d的赭曲霉孢子從PDA斜面上洗下，經(jīng)4層紗布過濾后用玻璃珠打散，再用無菌水稀釋成107個/mL。取上述100 μL孢子懸液分別涂布于含有潮霉素B（濃度分別為0、50、100、150和200 μg/mL）的PDA平板上。放于28℃培養(yǎng)5 d，觀察結果。每個濃度重復3次。

1.2.3 農(nóng)桿菌的轉化和培養(yǎng) 將構建好的載體（pPZP-hph）通過電擊轉化［18］的方法轉入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)中，將驗證成功的陽性單克隆轉化子在YEB（含卡那霉素50 μg/mL）平板上劃線，28℃培養(yǎng)72 h后，放于4℃?zhèn)溆?。挑取上述農(nóng)桿菌于含有5 mL的液體YEB（50 μg/mL）試管中，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，6 000 r/min，離心8 min收集菌體。用IM液體培養(yǎng)基重懸菌體，此時調(diào)整農(nóng)桿菌懸液OD600至0.5，并加入AS（濃度200 μmol/L）。放于28℃，180 r/min搖床中進行誘導培養(yǎng)。將農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD600=0.6、0.7、0.8、0.9、1.0時，分別取樣備用。

1.2.4 不同孢齡的赭曲霉孢子懸液的制備 保存在4℃中1個月的赭曲霉斜面用無菌水將孢子洗下，無菌紗布過濾后，用無菌水稀釋成1×107個/mL備用。將在28℃中培養(yǎng)5、6、7、8 d的赭曲霉斜面同上述方法分別稀釋成1×107個/mL備用。

1.2.5 赭曲霉不同孢子濃度的制備 用無菌水將培養(yǎng)5 d的赭曲霉孢子從PDA斜面上洗下，經(jīng)4層無菌紗布過濾除去菌絲體，并用無菌的玻璃珠將孢子打散均勻。將上述孢子懸液用無菌水稀釋成濃度為1×106、107、108和109個/mL。

1.2.6 轉化子的驗證以及遺傳穩(wěn)定性的鑒定 隨機挑選了8個赭曲霉陽性轉化子，提取其基因組DNA，用引物HYG-F和HYG-R對轉化子的基因組DNA進行擴增。并以野生型赭曲霉基因組作為對照。

2 結果

2.1 載體構建

構建含有潮霉素B基因的重組質(zhì)粒pPZP-hph，

構建流程，如圖1所示。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增得到的潮霉素B基因的片段（約1 390 bp），經(jīng)Hind III和XhoI酶切驗證得到的6 500 bp和2 432 bp的DNA片段如圖2所示，證明含有潮霉素B篩選標記的重組質(zhì)粒pPZP-hph構建成功。

圖1 重組質(zhì)粒（pPZP-hph）的構建

圖2 重組載體PCR（A）及酶切驗證（B）結果

2.2 潮霉素B對赭曲霉最小抑制濃度的確定

將赭曲霉培養(yǎng)在含有不同濃度潮霉素B的PDA平板上，觀察其生長情況。結果如表1所示，隨著潮霉素B的濃度不斷提高，赭曲霉的生長逐漸受到抑制。當潮霉素濃度為200 μg/mL時，赭曲霉不能生長。

表 1 赭曲霉41060對潮霉素B的敏感性

2.3 農(nóng)桿菌濃度對轉化效率的影響

將農(nóng)桿菌濃度OD600=0.6、0.7、0.8、0.9和1.0的菌懸液分別取200 μL與200 μL的1×107個/mL的赭曲霉孢子懸液混合，涂布于貼有0.45 μm的纖維素膜的IM（含卡那霉素50 μg/mL，AS 200 μmol/L）培養(yǎng)基上。放于25℃中共培養(yǎng)48 h后，再將上述纖維素膜倒貼于PDA（含有潮霉素B 200 μg/mL，頭孢霉素20 μg/mL）平板上。放于28℃繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，再對PDA平板上的轉化子進行篩選。結果如圖3所示，隨著農(nóng)桿菌濃度的升高，轉化子個數(shù)也逐漸增多，當農(nóng)桿菌濃度達到OD600=0.8得到的轉化子個數(shù)最多。

圖3 農(nóng)桿菌濃度對轉化效率的影響

2.4 赭曲霉的孢齡對介導轉化效率的影響

分別取已制備的不同孢齡的200 μL赭曲霉孢子懸液和200 μL OD600=0.7的農(nóng)桿菌懸液涂布于IM固體培養(yǎng)基上在25℃共培養(yǎng)48 h后，轉接到PDA平板上放于28℃培養(yǎng)，篩選轉化子。 結果如圖4所示，對于新鮮培養(yǎng)的孢子，除了培養(yǎng)5 d的孢子轉化效率比較低，培養(yǎng)6、7和8 d的孢子轉化效率要遠遠高于保存1個月的赭曲霉孢子。其中，培養(yǎng)6 d的

赭曲霉孢子轉化率最高。

圖4 赭曲霉孢齡對轉化效率的影響

2.5 赭曲霉不同孢子濃度對轉化效率的影響

分別取已制備的不同濃度的赭曲霉孢子懸液200 μL和OD600=0.7的農(nóng)桿菌懸液200 μL涂布于IM固體培養(yǎng)基上在25℃共培養(yǎng)48 h后，轉接到PDA平板上放于28℃培養(yǎng)，篩選轉化子。

結果如圖5所示，在赭曲霉孢子濃度為1×108個/mL時，轉化效率明顯較高，低于這個濃度時，轉化效率下降。在孢子濃度為1×109個/mL時，平板上的單菌落也較多，但是其中的假陽性也較多，所以綜合來看，其轉化效率相對較低。

圖5 赭曲霉孢子濃度對轉化效率的影響

2.6 最佳共培養(yǎng)溫度的確定

將農(nóng)桿菌在含有AS的IM液體培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)至OD600=0.8時，取200 μL菌液與等體積的濃度1×108個的赭曲霉孢子懸液混合，在22、24、26和28℃下共培養(yǎng)，轉膜到含有潮霉素B的PDA平板上，篩選轉化子檢測侵染效率。 如圖6所示，最佳共培養(yǎng)溫度為24℃，高于24℃時，農(nóng)桿菌生長過快。低于或高于這個溫度時，轉化效率都不高。

圖6 共培養(yǎng)溫度對轉化效率的影響

2.7 最佳共培養(yǎng)時間的確定

將農(nóng)桿菌在含有AS的IM液體培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)至OD600=0.8時，取200 μL菌液與等體積的濃度1×108個的赭曲霉孢子懸液混合，在24℃下共培養(yǎng)24、48、72 h后，轉膜到含有潮霉素B的PDA平板上，篩選轉化子檢測侵染效率。 如圖7所示，最佳共培養(yǎng)時間為48 h，低于這個時間，轉化效率明顯降低。高于這個溫度時，產(chǎn)生的假陽性較多。

圖7 共培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

2.8 轉化子PCR驗證和遺傳穩(wěn)定性的鑒定

從平板上隨機挑選8個赭曲霉轉化子，并且以野生型赭曲霉做為對照，提取基因組DNA進行PCR驗證，8個轉化子均能擴增出潮霉素片段約為1 390 bp，然而野生型赭曲霉的基因組作為模板時不能擴增出潮霉素基因的片段。結果如圖8所示。

隨機挑選8個陽性轉化子轉接至不含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)10代后，

將其轉接至含有潮霉素B終濃度為200 μg/mL 的PDA平板上。發(fā)現(xiàn)轉化子仍能正常生長，保持了對潮霉素B抗性的穩(wěn)定性。由此表明突變體獲得的潮霉素抗性基因能夠穩(wěn)定的遺傳。

圖8 赭曲霉轉化子PCR驗證

3 討論

甾體激素藥物是僅次于抗生素的第二類藥物，具有很強的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用［19］。目前我國對赭曲霉的研究主要是應用其對環(huán)氧黃體酮、4-AD和左旋乙基甾烯雙酮進行C-11α羥基化。甾體微生物轉化的方法與之前化學轉化法相比在一定程度上提高了轉化效率，但距離真正的工業(yè)生產(chǎn)還存在一定的差距。例如，赭曲霉在進行甾體微生物轉化過程中會產(chǎn)生一種磚紅色色素，影響產(chǎn)物的分離純化［20］，并且現(xiàn)有菌株轉化率不高。因此甾體轉化工業(yè)急需引入新的技術手段或新思路來改善現(xiàn)狀。

根癌農(nóng)桿菌介導轉化赭曲霉會受到很多因素的影響。首先，要選用新鮮的赭曲霉孢子。赭曲霉孢子培養(yǎng)時間不能太短，這可能是由于孢子還不夠成熟。孢子培養(yǎng)時間過長，轉化率也會有所下降。而且保存時間太久的孢子根本不能用于介導轉化。

根癌農(nóng)桿菌的菌懸液濃度和赭曲霉孢子懸液的濃度也極其重要。二者各自有其最佳濃度，高于或低于這個最佳濃度都會導致轉化率的下降。當農(nóng)桿菌濃度增加到OD600=0.8以上時，轉化率并沒有升高反而有下降的趨勢。這可能是由于農(nóng)桿菌的濃度增高導致其過度生長［21］，抑制了赭曲霉的生長，從而導致了轉化效率的下降。經(jīng)查閱其他研究報道，根癌農(nóng)桿菌對其他絲狀真菌進行介導轉化時，都要對二者的初始濃度進行優(yōu)化，可見其對農(nóng)桿菌侵染效率的影響［22］。

共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時間同樣是介導轉化中的重要因素。農(nóng)桿菌的最佳培養(yǎng)溫度為28℃，但在介導轉化中，溫度過低，農(nóng)桿菌不能生長。而溫度過高又使得農(nóng)桿菌生長過快，也會造成假陽性的產(chǎn)生。因此需要選擇一個最佳共培養(yǎng)溫度。同樣，共培養(yǎng)時間太短，侵染過程還沒有完全，而共培養(yǎng)時間太長，又會造成假陽性轉化子太多［23］。

總之，該轉化體系的成功構建在一定程度上解決了赭曲霉菌株定向改造的困難，并為赭曲霉基因的其他相關研究提供了重要工具。

4 結論

本試驗選用農(nóng)桿菌LBA4404，以赭曲霉TCCC41060為受體菌株，以潮霉素B為篩選標記，成功地建立了根癌農(nóng)桿菌介導的赭曲霉的遺傳轉化體系。并成功優(yōu)化了影響介導轉化過程的主要因素，獲得了較高轉化率。

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（責任編輯 李楠）

Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation System of Aspergillus ochraceus

Cui Qian Li Jie Liu Xiaoguang
（Tianjinn Key Laboratory of Industrial Microbiology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology Ministry of Education，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457）

Filamentous fungus Aspergillus ochraceus TCCC41060 is an industrial strain used for microbial steroid C11-α hydroxylation. In order to create genetic tools for A. ochraceus, the transformation system of A. ochraceus was established using Agrobacterium tumefaciensmediated system（ATMT）. A. tumefaciens LBA4404 was used as the infective strain and hygromycin B gene as the selection marker. The major factors affecting the transformation efficiency including the concentrations of A. tumefaciens cell and A. ochraceus spores, co-culture time, and co-culture temperature were investigated. Under the best conditions, the transformation efficiency of 57 transformants/107spores was obtained. A. ochraceus transformants were confirmed by PCR amplification . Randomly selected 8 transformants were shown to be genetically stable after 10 rounds of successive cultivation. Results indicated this ATMT transformation system would provide important means for the directed genetic manipulation of this important industrial strain A. ochraceus TCCC41060.

Aspergillus ochraceus Agrobacterium tumefaciens Transformantion system

2013-12-05

崔倩，女，碩士，研究方向：赭曲霉11α-羥化酶基因；E-mail：cuiqianyi@163.com

劉曉光，男，教授，碩士生導師，研究方向：酶與應用微生物；E-mail：liu_xg@tust.edu.cn