宣曉梅 李英濤 劉 靜 李艷佳 劉麗娟

白念珠菌誘導(dǎo)不同來源樹突狀細(xì)胞分化成熟能力的比較

宣曉梅 李英濤 劉 靜 李艷佳 劉麗娟

目的: 比較白念珠菌誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)和小鼠骨髓源DCs兩者分化成熟能力的差異。方法: 體外培養(yǎng)正常人外周血單核細(xì)胞源DCs和小鼠骨髓源DCs,隨機(jī)分為空白組、無(wú)菌鹽水對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。光鏡下觀察DCs細(xì)胞的形態(tài)變化。結(jié)果: 小鼠骨髓源與人外周血單核細(xì)胞源DCs CD80、CD86及IL－12分泌量與加入的白念珠菌懸液劑量成正相關(guān),小鼠骨髓源DCs在各組間增加幅度明顯高于人外周血單核細(xì)胞源DCs(均P＜0.05)；白念珠菌刺激前后小鼠骨髓源DCs形態(tài)變化程度較明顯,而人外周血DCs形態(tài)未見明顯變化。結(jié)論: 白念珠菌可促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞源DCs和小鼠骨髓源DCs的成熟；在相同條件下,白念珠菌更易促進(jìn)小鼠骨髓源DCs分化。

樹突狀細(xì)胞； 白念珠菌

白念珠菌是自然界最常見的致病性真菌之一,是人類重要的條件致病菌之一,可引起女性外陰陰道念珠菌病,也可以因各種介入性診療、抗菌素長(zhǎng)期大量應(yīng)用、機(jī)體免疫功能低下或缺陷引起致命性的系統(tǒng)性感染。隨著人類抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用,白念珠菌對(duì)各種抗真菌藥物的耐藥性逐年增加,1－3給臨床白念珠菌感染的治療帶來一定困難,從免疫學(xué)角度出發(fā)的治療方法也許會(huì)成為一個(gè)嶄新領(lǐng)域。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是最重要的抗原提呈細(xì)胞,可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和表達(dá)表面分子等,誘導(dǎo)T細(xì)胞向不同類型Th細(xì)胞分化,在T細(xì)胞免疫中起重要的調(diào)節(jié)作用,是許多抗感染免疫的起點(diǎn)和調(diào)節(jié)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過在人外周血單核細(xì)胞源DCs及小鼠骨髓源DCs培養(yǎng)過程中,加入標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌成份溶液刺激,觀察兩者刺激前后形態(tài)變化程度、表面分子及細(xì)胞因子增加幅度的差別,比較白念珠菌誘導(dǎo)兩者致敏效果及分化成熟的能力是否存在差別。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人外周血(購(gòu)自河北省血液中心)、試驗(yàn)菌株白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231(河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室提供)、重組人GM－CSF和IL－4(美國(guó)PEPRO TECH Asia公司)、PE抗人CD80、CD86抗體(美國(guó)Baker Catalog公司)。試驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J 6～8周齡小鼠(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)、rmGM－CSF、rm IL－4(美國(guó)PeproTech公司)、PE抗鼠CD80、CD86熒光抗體(美國(guó)eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 白念珠菌溶液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10-231置于沙保氏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48 h,挑取適量菌落用無(wú)菌生理鹽水洗3遍,借助微量天秤配成0.1 mg/mL無(wú)菌生理鹽水懸液,再用超聲波破碎儀將其徹底粉碎備用。

1.2.2 人外周血樹突狀細(xì)胞的分離及誘導(dǎo) 取正常人外周血10 mL,肝素抗凝后,加入10 mL磷酸鹽緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS)稀釋混勻,置淋巴細(xì)胞分離液上, 2000 r/min,離心30 min。吸取白膜層細(xì)胞,2000 r/ min,離心20 min,去上清,加入PBS 5 mL,吹打均勻,再以1000 r/min,離心8 min,獲得單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液5mL中吹打均勻,置于6孔培養(yǎng)板中,濃度調(diào)整為1× 106個(gè)/mL,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁3 h,去除上清及懸浮細(xì)胞,每孔加入PRMI 1640完全培養(yǎng)基3 mL,GM－CSF(50 ng/m L)和IL－4(10 ng/mL)各150 μL,繼續(xù)培養(yǎng),隔天換液至第7 d。

1.2.3 小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的分離及誘導(dǎo) 斷頸處死C57BL/6J小鼠,用剪刀和齒鑷游離皮膚后,自踝關(guān)節(jié)及髖關(guān)節(jié)處獲取股骨和脛骨,置于75%的乙醇中浸泡20min、PBS沖洗3遍。剪去股骨和脛骨兩端完全暴露骨髓腔,用盛有7 mL PBS的10 mL注射器將骨髓細(xì)胞沖入培養(yǎng)皿中。將獲得的骨髓細(xì)胞通過篩網(wǎng)去除顆粒后收集于離心管,1500 r/min,離心5 min,棄上清。加紅細(xì)胞裂解液5 mL裂解2 min,加5 mL PBS終止反應(yīng),1500 r/min,離心5 min,棄上清,5 mL PBS沖洗2次,離心去上清,獲得骨髓單細(xì)胞懸液。將其置于6孔培養(yǎng)板中,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/L,加RPMI 1640完全培養(yǎng)基2 m L(內(nèi)含10～20 ng/mL小鼠重組GM－CSF,1 ng/m L小鼠重組IL－4),37℃5%CO290%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后水平晃動(dòng)培養(yǎng)板20次,全量換液去除未貼壁細(xì)胞。第3～7 d隔天半量換液。

1.2.4 白念珠菌作用于樹突狀細(xì)胞 培養(yǎng)第7 d,人外周血DCs和小鼠骨髓源DCs均隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)前組20孔、對(duì)照組20孔和實(shí)驗(yàn)組60孔。刺激前組直接收集DCs及培養(yǎng)上清,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL用于流式檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組再分為3組每組20孔,分別加入0.5m L、1 mL、1.5 mL配好的白念珠菌溶液,對(duì)照組加入同等劑量無(wú)菌生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.5 細(xì)胞收集 吹打六孔板,使所有的細(xì)胞懸浮,分別收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清,用于下一步檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)的觀察 在培養(yǎng)的8 d中,通過顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況,注意觀察加入白念珠菌溶液前后及各劑量組間DCs的形態(tài)是否有差異；觀察人DCs實(shí)驗(yàn)組和小鼠DCs實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)變化程度有無(wú)差別,并進(jìn)行拍照。

1.2.7 流式細(xì)胞儀測(cè)定DCs表面分子CD80、CD86的表達(dá) 將各組細(xì)胞用生理鹽水稀釋后,濾去細(xì)胞團(tuán)塊,收集單細(xì)胞懸液,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ m L。人外周血DCs分別加入PE標(biāo)記的鼠抗人CD80和CD86抗體,小鼠骨髓源DCs加入PE抗鼠CD80、CD86熒光抗體,避光室溫孵育30 min,離心棄上清,去除游離的熒光抗體,PBS洗滌細(xì)胞2次,再用PBS懸浮細(xì)胞,置于流式細(xì)胞儀測(cè)定CD80和CD86。

1.2.8 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL－12 各組培養(yǎng)上清液采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定IL－12含量,步驟按試劑盒說明書操作。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示。用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析及配對(duì)資料秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 DCs形態(tài)觀察 通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),人外周血DCs于培養(yǎng)第7 d,細(xì)胞逐漸從聚集狀態(tài)變?yōu)榉稚顟B(tài),細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,表面有部分毛刺狀突起,分化成非成熟DCs。加入不同劑量白念珠菌溶液刺激后,對(duì)照組和各劑量實(shí)驗(yàn)組與刺激前組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別(圖1)。

由小鼠骨髓分離DCs于培養(yǎng)的第7 d,部分細(xì)胞有細(xì)長(zhǎng)突起形成,偶見帶有明顯刺突的DCs。加入不同劑量白念珠菌溶液刺激后,對(duì)照組與刺激前無(wú)明顯變化,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞刺突增多、加長(zhǎng),形態(tài)更趨于成熟,各劑量實(shí)驗(yàn)組間DCs形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別(圖2)。

2.2 DCs表面分子的表達(dá) 人外周血DCs對(duì)照組加入無(wú)菌生理鹽水刺激后,CD80、CD86表達(dá)量與刺激前組比較無(wú)顯著性差異(tCD80＝0.13、tCD86＝0.67,P＞0.05)。0.5、1、1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)菌成分溶液刺激實(shí)驗(yàn)組, CD80、CD86表達(dá)量與白念珠菌懸液劑量成正相關(guān)(FCD80＝4579.58、FCD86＝6041.48,均P＜0.05)(圖3,表1)。

小鼠骨髓DCs對(duì)照組加入無(wú)菌生理鹽水刺激后, CD80、CD86表達(dá)量與刺激前組比較也無(wú)顯著性差異(tCD80＝0.09、tCD86＝0.52,P＞0.05)。刺激前組及加入0.5、1、1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)菌成分溶液刺激實(shí)驗(yàn)組,CD80、CD86表達(dá)量與白念珠菌懸液劑量成正相關(guān)(FCD80＝38682.09、FCD86＝1705.50,均P＜0.05)(圖4,表1)。

0.5 m L組與刺激前比較、1 mL組與0.5 mL組比較、1.5 m L組與1 mL組比較人外周血來源DCs表面分子CD80增加幅度小于小鼠骨髓源DCs(T＝189,T＝200,T＝210,均P＜0.05),CD86增加幅度亦小于小鼠骨髓源DCs(T＝204,T＝196,T＝210,均P＜0.05) (表2)。

圖1 倒置顯微鏡下各組人外周血單核細(xì)胞源DCs形態(tài)(×200)

圖2 熒光顯微鏡下各組小鼠骨髓源DCs形態(tài)(×200)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組人外周血單核細(xì)胞源DCs表面CD80、CD86

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠骨髓源DCs表面CD80、CD86

2.3 細(xì)胞因子IL－12測(cè)定 人外周血DCs對(duì)照組加入無(wú)菌生理鹽水刺激后,IL－12分泌量與刺激前組比較無(wú)顯著性差異(tIL－12＝0.64,P＞0.05)；刺激前組及加入0.5、1、1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)菌成分溶液刺激實(shí)驗(yàn)組中,各組IL－12分泌量與白念珠菌成份溶液劑量成正相關(guān)(FIL－12＝133074.97,P＜0.05),見表1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80和CD86、ELISA法檢測(cè)IL－12結(jié)果

小鼠骨髓源DCs對(duì)照組加入無(wú)菌生理鹽水刺激后,IL－12分泌量與刺激前組比較無(wú)顯著性差異(tIL－12＝0.44,P＞0.05)；刺激前組及加入0.5、1、1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)菌成分溶液刺激中,各組IL－12與白念珠菌成分溶液劑量成正相關(guān)(FIL－12＝1285036.14,P＜0.05),見表1。

0.5 m L組與刺激前比較、1 mL組與0.5 m L組比較、1.5mL組與1mL組比較IL－12分泌量,人外周血來源DCs增加幅度小于小鼠骨髓源DCs(T＝185,T＝210,T＝207,均P＜0.05),見表2。

表2 兩種來源DCs各組之間CD80和CD86及IL－12差值

3 討論

DCs源于體內(nèi)的多能造血干細(xì)胞,可分為髓系來源和淋巴系來源兩大類,其廣泛存在于淋巴、非淋巴組織及體液中,具有攝取、處理、呈遞抗原給T細(xì)胞使其活化并產(chǎn)生影響天然及獲得性免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞因子的功能,是啟動(dòng)和維持免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能的重要成員之一。樹突狀細(xì)胞作為機(jī)體抵抗外界病原體入侵的第一道防線中的重要成員,時(shí)刻監(jiān)視著機(jī)體環(huán)境中的各種外來因子,是針對(duì)包括細(xì)菌、真菌等成分在內(nèi)的各種病原體引起免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)者。4,5但正常情況下,機(jī)體內(nèi)絕大多數(shù)DCs均處于非成熟狀態(tài),雖具有一定的抗原加工和處理能力,但表面缺乏或低表達(dá)MHC分子和表面分子(如CD80、CD86等),僅分泌少量細(xì)胞因子(如IL－12等)。只有在外來抗原作用下,才分化為成熟DCs,高水平表達(dá)表面分子CD80、CD86及增加IL－12分泌等,繼而激活T細(xì)胞,啟動(dòng)各種免疫應(yīng)答反應(yīng)。6

本實(shí)驗(yàn)將相同劑量的粉碎后白念珠菌加入人類外周血單核細(xì)胞源DCs和小鼠骨髓源DCs培養(yǎng)皿中,觀察作為外界抗原物質(zhì)的白念珠菌對(duì)兩者致敏效果是否存在差別,即促進(jìn)兩者成熟的能力是否存在差別。結(jié)果表明,粉碎后白念珠菌對(duì)小鼠骨髓源DCs細(xì)胞形態(tài)、表面分子及細(xì)胞因子的影響均大于對(duì)人類外周血單核細(xì)胞源DCs,即白念珠菌更易促進(jìn)小鼠骨髓源DCs的分化成熟。為了排除生理鹽水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,我們用生理鹽水作對(duì)照,結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)兩類樹突狀細(xì)胞分化成熟均無(wú)促進(jìn)作用,與以往研究結(jié)果一致。7以往報(bào)道相關(guān)抗原致敏DCs已經(jīng)在人類某些難治性疾病如病毒感染、腫瘤等治療中起到一定的積極作用,8－10白念珠菌致敏樹突狀細(xì)胞在各類動(dòng)物模型包括小鼠模型中獲得的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)?zāi)芊駷槲覀內(nèi)祟愄峁﹨⒖?還需我們進(jìn)一步細(xì)致深入的研究。

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(收稿:2013－07－10 修回:2013－09－09)

Com parison of the effects of Candida albicans on them aturation of the dend ritic cells from the different sources

XUAN Xiao-mei,LIYing-tao,LIU Jing,et al.Department ofDermatology and Venereology,The FirstHospital ofHebeiMedical University,Shijiazhuang,050031

Objective:To compare the effects of Candida albicans on the maturation of dendritic cells (DCs)derived from bonemarrow ofmouse and the peripheral blood monocyte of human.Methods:The two types of DCswere obtained by culture in vitro.The cellswere randomly divided into blank control group,normal saline solution group and experimental group.Themorphological changes of the cellswere observed under themicroscope.Results:The amountof CD80,CD86 and IL－12 secreted by DCs derived from bonemarrow ofmouse and the peripheral blood monocytes of human was positively correlated with the added amount of supernate of cultured Candida albicans.The secreted amount of CD80,CD86 and IL－12 was higher in DCs groups than in groups of peripheral blood monocytes of human(P＜0.05).Themorphological changeswere observed in DCs groups,butwasnot in the groups of peripheral blood monocytes of human.Conclusion:Candida albicans can enhance thematuration of the DCs derived from themouse and human,especially for the former in the same condition.

dendritic cells；Candida albicans

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科,石家莊,050031