方光遠(yuǎn)，季鳳娟，胡志華，陳俊紅，顧亞鳳，蔣加進(jìn)

(1.金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038；2.江蘇省南通市通州區(qū)二甲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，江蘇 南通 226321)

肉鴿大腸桿菌病是由各種不同血清型大腸桿菌引起的病鴿出現(xiàn)以腹瀉為主要癥狀的一類疫病，臨床上患病肉鴿癥狀多呈呼吸困難、羽毛雜亂、精神萎靡、排出黃白色稀糞、呆立、閉眼、腿爪干燥，發(fā)病后死亡率較高[1]。本病一年四季均可發(fā)生，尤以冬季和夏季最為常見，病鴿是造成該病最主要的傳染源。本試驗(yàn)從南京地區(qū)7只發(fā)病剛死亡的20日齡病乳鴿(美國王鴿)肝臟中分離到7株細(xì)菌，對這些分離細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、形態(tài)染色、生化試驗(yàn)、16SrDNA基因片段序列測定。通過藥敏試驗(yàn)獲得了分離菌敏感藥物和耐藥性數(shù)據(jù)，為臨床預(yù)防和治療肉鴿大腸桿菌病提供了參考?，F(xiàn)將試驗(yàn)過程和鑒定結(jié)果報(bào)告如下。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 S.S瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、普通營養(yǎng)肉湯和三糖鐵瓊脂斜面，自行配制。

1.1.2 微量鑒定管 腸桿菌科細(xì)菌GYZ-15e生化編碼鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 藥敏紙片 所用14種藥敏紙片有：氨芐西林(20 μg/片)、頭孢哌酮(30 μg/片)、頭孢呋辛(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、多粘菌素B(30 μg/片)、諾氟沙星(5 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片)。均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌O抗原因子定型血清 標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌O1、O2、O4、O5、O6、O8、O9、O15、O20、O21、O26、O35、O36、O78、O81、O86、O101、O103、O111、O115、O117、O137“O”抗原定型血清22種，此22種大腸桿菌“O”抗原血清型為畜禽常見致病性大腸桿菌血清型，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.5 細(xì)菌16 SrDNA基因片段PCR檢測試驗(yàn)試劑 2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 Marker、超純水，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采集南京地區(qū)7只發(fā)病剛死亡的20日齡病乳鴿(美國王鴿)肝臟病料分別接種于SS瓊脂平板上，做上標(biāo)簽，37 ℃培養(yǎng)24 h。取生長典型的單個(gè)菌落再分區(qū)劃線接種于SS瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板、穿刺接種于三糖鐵瓊脂斜面和營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)和在三糖鐵瓊脂斜面及營養(yǎng)肉湯中生長情況。

1.2.2 細(xì)菌染色鏡檢 取純培養(yǎng)物在潔凈載玻片上抹片，干燥，火焰固定后，進(jìn)行革蘭氏染色，然后在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 細(xì)菌的生化特性鑒定 取分離細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種腸桿菌科細(xì)菌GYZ-15e生化編碼鑒定管，置37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察結(jié)果。

1.2.4 血清型鑒定 將分離到的上述7種細(xì)菌純培養(yǎng)物用生理鹽水洗滌，收集于2 mL塑料試管中，8 000 r/min離心15 min洗滌2次，稀釋成100億/mL菌液，用電熱高壓蒸汽滅菌鍋15磅121 ℃高壓2 h，破壞其菌毛抗原，用下面22種標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌O1、O2、O4、O5、O6、O8、O9、O15、O20、O21、O26、O35、O36、O78、O81、O86、O101、O103、O111、O115、O117、O137“O”抗原定型血清分別與上述菌液作玻片凝集試驗(yàn)，鑒定“O”抗原種類。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 應(yīng)用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B 法)測定7株分離菌對臨床常用14種抗菌藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI文件M02-A11(抗菌藥物敏感試驗(yàn)紙片法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，批準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)-第十一版)判定分離細(xì)菌的敏感(高敏)、中介(中敏)與耐藥百分率。

1.2.6 分離細(xì)菌16SrDNA基因片段序列測定 根據(jù)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了1對引物，對7株分離菌16SrDNA 439 bp基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上下游引物序列分別為：上游引物F：5′-GGG AGC AAA CAG GAT TAG A-3′；下游引物R：5′-AGG GCC ATG ATG ACT TGA-3′。引物由寶生生物工程(大連)有限公司合成。PCR擴(kuò)增過程及測序如下：①DNA模板制備： 取37 ℃培養(yǎng)24 h的7株分離菌肉湯培養(yǎng)物2 mL，4 ℃、10 000 r/min離心2 min，傾去上清液，加入無菌水2 mL，混勻4 ℃、10 000 r/min離心2 min，傾去上清液，加入無菌水2 mL混勻4 ℃保存?zhèn)溆?；②目的基因片段的擴(kuò)增及測序：采用25 μL體系： 2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，雙蒸水11 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min ，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳后在可見紫外光檢測儀中觀察，若條帶清晰，隨機(jī)選取1株分離菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至寶生生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將無菌采集的發(fā)病剛死亡7份鴿病料接種于S.S瓊脂平板上，分離到7株細(xì)菌。7株細(xì)菌分別分區(qū)劃線接種于S.S平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h結(jié)果如下：接種于S.S瓊脂平板上的菌落為圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、菌落呈紅色、菌落直徑為2 mm左右；接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈圓形、隆起、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、無色半透明、菌落直徑為2 mm左右。7株細(xì)菌于三糖鐵瓊脂中斜面均呈黃色，底部有大量氣泡產(chǎn)生，不產(chǎn)生H2S。7株細(xì)菌于營養(yǎng)肉湯中呈均勻渾濁狀態(tài)。

2.2 細(xì)菌染色鏡檢結(jié)果

7株分離菌均為革蘭氏陰性中等大小的桿菌，菌體兩端鈍圓，單個(gè)存在，菌體大小1～3 μm×0.4～0.7 μm，無芽孢和莢膜。

2.3 細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

7株分離菌純培養(yǎng)物分別接種于腸桿菌科細(xì)菌GYZ-15e生化編碼鑒定管，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果，按照腸桿菌科細(xì)菌GYZ-15e生化鑒定編碼冊介紹的計(jì)算鑒定總值方法，計(jì)算每株細(xì)菌鑒定總值，7株分離菌鑒定總值分別為06311、06335、06365、06335、46365、06375、06375，然后查腸桿菌科細(xì)菌GYZ-15e生化鑒定編碼冊檢索表，7株分離菌鑒定結(jié)果表明均為大腸桿菌。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)鑒定結(jié)果表明，7株鴿大腸桿菌血清型其中5株為O2型，2株為O78型。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將7株分離細(xì)菌應(yīng)用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B 法)測定對14種臨床常用抗菌藥物的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果表明，7株分離菌對頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、多粘菌素B 4種藥物100%敏感，對頭孢哌酮敏感率為85.7%，對慶大霉素、呋喃妥因敏感率均為71.4%。對臨床常見的藥物氨芐西林、鏈霉素、丁胺卡那耐藥率分別高達(dá)85.7%、71.4%和85.7%。對氟喹諾酮類諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率也都較高，分別為71.4%、57.1%和71.4%。

2.6 細(xì)菌16SrDNA測序結(jié)果

7株分離菌16SrDNA 439 bp基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。7株分離菌均擴(kuò)增出16SrDNA 439 bp基因片段。

注：M代表DL2 000 DNA marker；1-7代表7株分離菌樣品圖1 7株分離菌16SrDNA 439 bp基因片段PCR電泳圖Fig.1 The PCR electrophoresis of 16SrDNA 439 bp gene of 7 bacteria

隨機(jī)選取1株分離菌16SrDNA 439 bp基因片段PCR產(chǎn)物送寶生生物工程(大連)有限公司測序，結(jié)果獲得407 bp序列，將此407 bp核苷酸片段測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)進(jìn)行blast，結(jié)果表明，此分離菌407 bp核苷酸片段與GenBank中已知8株大腸桿菌(序列號分別為：KJ477007、CP007136、CP006027、CP006784、KF768068、KF771032、CP007133、CP006262)對應(yīng)核苷酸片段同源性均高達(dá)99%以上。

3 結(jié)論與討論

1)7株病鴿分離菌根據(jù)生化反應(yīng)鑒定結(jié)果表明，該7株病鴿分離菌均為大腸桿菌。7株分離菌的菌落和形態(tài)染色特性也均與大腸桿菌相符合。

2)通過對7株分離菌進(jìn)行“O”因子抗原血清型鑒定，7株肉鴿分離菌血清型其中5株為O2型，2株為O78型。這也與趙寶華[2]報(bào)道的肉鴿大腸桿菌血清型基本相符合。

3)本試驗(yàn)分離到的7株肉鴿大腸桿菌對頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、多粘菌素B 4種藥物100%敏感，對頭孢哌酮敏感率為85.7%，對慶大霉素、呋喃妥因敏感率均為71.4%，這可能由于上述7種藥物沒有或很少用于鴿病的臨床治療。對臨床常見的藥物氨芐西林、鏈霉素、丁胺卡那耐藥率分別高達(dá)85.7%、71.4%和85.7%，對氟喹諾酮類藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率也都較高，分別為71.4%、57.1%和71.4%，這可能由于上述藥物較多用于鴿病的臨床治療。由于鴿大腸桿菌耐藥性的廣泛存在，因此在鴿大腸桿菌病臨床治療中，通過藥敏試驗(yàn)篩選高敏藥物對發(fā)病鴿進(jìn)行治療，避免耐藥性的產(chǎn)生具有較大的意義[3]。

4)本試驗(yàn)從7株分離菌中隨機(jī)選取1株分離菌進(jìn)行16SrDNA 439 bp基因片段PCR擴(kuò)增及序列分析，結(jié)果表明，該株分離菌16SrDNA 407 bp核苷酸片段與GenBank中已知8株大腸桿菌對應(yīng)核苷酸片段同源性均高達(dá)99%以上，進(jìn)一步證實(shí)了所分離菌為鴿大腸桿菌[4]。

5)通過對7株分離細(xì)菌的一系列試驗(yàn)研究，探明了南京市肉乳鴿發(fā)病死亡的原因，針對發(fā)病情況對肉鴿養(yǎng)殖場提出了實(shí)行全進(jìn)全出飼養(yǎng)、徹底消毒消滅病原的建議，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取有效藥物用于治療和預(yù)防，通過采取上述措施控制了肉乳鴿的發(fā)病死亡，取得了滿意的治療和預(yù)防效果。

[1] 邵慧君，張彬彬，王彥紅，等.肉鴿大腸桿菌病的診斷[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011(2):112

[2] 趙寶華，卜柱，徐步，等.肉鴿大腸桿菌的分離與鑒定[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2010,14(4):225-227

[3] 徐斌，張夏蘭，何琴，等.乳鴿大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(9):123-124

[4] 錢琨，張永志，金文杰，等.致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的分離與16SrDNA的鑒定[J].中國家禽,2011,33(14):29-31