周建武，何 昀，龔夢嘉，畢 楊

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒研所干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市干細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心，重慶400014)

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A 在體內(nèi)的重要活性形式，在胚胎發(fā)育，組織器官形成，細(xì)胞的增殖分化，腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用［1］。全反式維甲酸主要通過與維甲酸核受體(α、β、γ 3 種亞型)結(jié)合激活維甲酸信號傳導(dǎo)途徑，參與下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，發(fā)揮維持機(jī)體正常生理穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)作用［2］。維甲酸核受體γ 是研究相對較少的一種亞型，主要與皮膚的發(fā)生、生長、分化及免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)相關(guān)［3－4］，目前RARγ 與肝臟相關(guān)疾病的研究較少，僅有少數(shù)報(bào)道顯示與脂肪代謝和肝腫瘤的發(fā)生有關(guān)［5－6］。

前期結(jié)果表明，ATRA 對小鼠胚胎肝臟祖細(xì)胞的成熟分化有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，而在小鼠肝臟發(fā)育過程中，胚胎期RARγ 的表達(dá)較低，但是在出生后呈現(xiàn)非常明顯的上調(diào)趨勢［7］，提示RARγ 在肝細(xì)胞成熟分化過程中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用Ad-easy 腺病毒系統(tǒng)，成功構(gòu)建并篩選出能有效抑制RARγ 表達(dá)的siRNA 腺病毒，并在體外探討RARγ 抑制對ATRA 誘導(dǎo)肝細(xì)胞成熟分化的影響，為研究維甲酸信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控肝臟正常發(fā)育及肝腫瘤的發(fā)生發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ad-easy 腺病毒系統(tǒng)(包括穿梭質(zhì)粒pSESHUS，攜帶腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1 的大腸桿菌BJ5183(由美國芝加哥大學(xué)何通川教授饋贈);來自于胚胎期14.5 d的小鼠胚胎肝臟祖細(xì)胞(Hepatic progenitor cells HP 14.5 d)由本實(shí)驗(yàn)室分離構(gòu)建［5］;DH5α 大腸桿菌、HEK293 細(xì)胞系、pALB-GLuc 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;內(nèi)切酶Sfi Ⅰ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ，Gaussia luciferase 檢測試劑盒(NEB 公司);內(nèi)切酶Kpn Ⅰ、EcoR Ⅴ，T4DNA 連接酶和RT-PCR 試劑盒(TAKARA 公司);2 ×PCR Premix(東勝生物公司);總RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒(Promega 公司)，LipofectamineTM2000、1 Kb Plus DNA Ladder(Invitrogen 公司);2 ×SYBR Green 反應(yīng)液(天根生物公司);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司);兔抗小鼠RARγ 多克隆抗體、兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(Santa cruz 公司);PCR引物由華大基因公司合成，基因測序在重慶醫(yī)科大學(xué)感染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARγ 的構(gòu)建:采用SiDESIGN 軟件設(shè)計(jì)3 對特異性針對小鼠RARγ 的siRNA 序列(表1)，體外退火(10 mmol/L正義鏈和反義鏈DNA 片段各10 μL混合，100 ℃，10 min，自然冷卻至室溫)形成兩端帶有Sfi Ⅰ黏性末端的雙鏈DNA，與經(jīng)Sfi Ⅰ酶切純化后的pSES-HUS 質(zhì)粒16 ℃連接過夜，電轉(zhuǎn)DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，卡那霉素抗性LB 平板上篩選單克隆菌落，搖菌提質(zhì)粒，PCR(反應(yīng)體系20 μL:2 μL質(zhì)粒模板，330 mg/L siRNA反義鏈和U6 啟動子引物各0.5 μL，2 ×PCR premix 10 μL，加水至20 μL;PCR 參數(shù):94 ℃2 min;94 ℃20 s，56 ℃20 s，72 ℃20 s，30 循環(huán);72 ℃2 min)及Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ雙酶切鑒定后送測序，獲得3 組pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。經(jīng)Pme Ⅰ酶切(50 μL體系:10 ×NEB 緩沖液5 μL，100 ×牛血清白蛋白0.5 μL，Pme Ⅰ1 μL，質(zhì)粒2 μg，加水至50 μL，37 ℃6 ～8 h)線性化后與pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入至BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，卡那霉素和鏈霉素篩選，PCR(引物及參數(shù)同前)和Pac Ⅰ酶切(50 μL體系:10 ×NEB 緩沖液5 μL，100 ×牛血清白蛋白0.5 μL，Pac Ⅰ1 μL，質(zhì)粒2 μg，加水至50 μL，37 ℃6 ～8 h)鑒定獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARγ。

表1 小鼠RARγ 的siRNA 序列Table 1 Sequences of siRNA for mouse RARγ

1.2.2 HEK293 細(xì)胞中包裝重組腺病毒AdsiRARγ:pAd-siRARγ 質(zhì)粒Pac Ⅰ酶切線性化備用，HEK293 細(xì)胞種植于底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶中過夜，匯合度達(dá)70% ～80%時用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。24 h后觀察紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的表達(dá)，之后每3 天觀察RFP 的表達(dá)變化及細(xì)胞病毒空斑狀態(tài)。10 ～14 d后，1/2以上細(xì)胞變圓漂浮時收集細(xì)胞，0.5 mL PBS 重懸，－80 ℃速凍，37 ℃復(fù)融共4 次，離心收集病毒上清，多次感染HEK293 細(xì)胞獲得高滴度病毒。

1.2.3 重組腺病毒滴度及感染復(fù)數(shù)的檢測:96 孔板，每孔接種293 細(xì)胞104個，孵箱培養(yǎng)24 h。將待測病毒用DMEM 全培養(yǎng)基稀釋至10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9和10－10稀釋度。吸去上清，分別加入每個稀釋度的病毒液體，每孔200 μL，每種樣本均作復(fù)孔，同時設(shè)培養(yǎng)基對照(不含腺病毒)。孵育36 ～48 h。鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，計(jì)算病毒滴度。病毒滴度計(jì)算公式:病毒滴度(PFU/mL)=RFP 陽性細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)(PFU)/稀釋后體積(mL)。小鼠HP 14.5 d 細(xì)胞按2 ×105細(xì)胞/孔接種于6 孔板，Ad-siRARγ 腺病毒感染細(xì)胞，同時設(shè)置Ad-RFP 對照組，每種病毒設(shè)10、20、40 和80 4 個感染復(fù)數(shù)(MOI:病毒PFU/細(xì)胞數(shù))，48 h后計(jì)數(shù)RFP 陽性細(xì)胞百分率，以50% ～60%RFP 陽性細(xì)胞孔為該病毒的最佳MOI。

1.2.4 Real-time PCR 及Western blot 篩選能有效抑制小鼠HP 14.5 d 細(xì)胞中RARγ 表達(dá)的AdsiRARγ:選擇最佳MOI 孔，在病毒感染3 d后提取細(xì)胞總mRNA，RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-time PCR檢測RARγ(上游:5'-GACCCAGCCAACCCTACAT-3'，下游:5'-ACATCTCCGGGTTCTCCAG-3')的表達(dá)(PCR 反應(yīng)體系20 μL:2 μL cDNA 模板，330 mg/L引物各0.5 μL，2 ×SYBR Green 反應(yīng)液10 μL，加水至20 μL;PCR 參數(shù):94 ℃3 min;94 ℃10 s，54 ℃20 s，72 ℃20 s，40 循環(huán);溶解曲線65 ℃～95 ℃每5 s增加0.5 ℃，讀板)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(上游:5'-GGCTGCCCAGAACATCAT-3'，下游:5'-CGGA CACATTGGGGGTAG-3'，PCR 參數(shù)同上)為內(nèi)參標(biāo)化各組cDNA 模板。同上設(shè)置各處理組，提取細(xì)胞總蛋白，等量蛋白進(jìn)行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V，2 h)，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(80 V，1 h)。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗RARγ(1∶200)或抗β-actin(1∶500)一抗，4 ℃過夜;TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗(1∶500)，室溫1 ～2 h，洗膜，ECL 發(fā)光，用Image Pro Plus 6.0 軟件分析吸收光度值。

1.2.5 ALB-Gluc 活性檢測Ad-siRARγ 對ATRA 誘導(dǎo)小鼠胚胎肝臟祖細(xì)胞成熟分化的影響:小鼠HP 14.5 d細(xì)胞按5 ×104細(xì)胞/孔接種于24 孔板，設(shè)置復(fù)孔，pBGLuc-ALB 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后Ad-RFP、Ad-siRARγ2、Ad-siRARγ3 以最佳感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞，48 h后加入1 μmol/L ATRA，隨后每3 天檢測培養(yǎng)上清中分泌的ALB-Gluc 活性。取各孔培養(yǎng)上清20 μL，放入1.5 mL EP 管中，加入新鮮配置的底物反應(yīng)液10 μL(反應(yīng)緩沖液∶底物=100∶1)，快速混合后立即置于多功能檢測儀下讀數(shù)。

1.2.6 PAS 染色檢測Ad-siRARγ 對ATRA 誘導(dǎo)的小鼠胚胎肝臟祖細(xì)胞功能的影響:小鼠HP 14.5 d細(xì)胞按5 ×104細(xì)胞/孔接種于24 孔板，設(shè)置復(fù)孔，Ad-RFP、Ad-siRARγ1、Ad-siRARγ3 以最佳感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞，48 h后加入1 μmol/L ATRA 誘導(dǎo)，12 d后進(jìn)行檢測。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入400 μL 4%多聚甲醛，固定10 min，PBS 洗滌3 次。加入400 μL 0.5%高碘酸試劑，室溫孵育5 min，PBS 洗滌3 次;加入400 μL席夫堿試劑，孵育15 min，流水沖洗2 ～3 min;加入100 μL蘇木精復(fù)染細(xì)胞1 ～2 min，流水沖洗直至澄清，以上操作均在室溫完成。置于倒置顯微鏡下觀察，選取10 個不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 pAd-siRARγ 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

RT-PCR 擴(kuò)增重組腺病毒質(zhì)粒pAd-siRARγ，可擴(kuò)增出約300 bp 的條帶(圖1)。正確重組的質(zhì)粒由于siRNA 片段插入后丟失EcoR Ⅴ酶切位點(diǎn)，Kpn Ⅰ及EcoR Ⅴ雙酶切無1 798 bp 的短片段(圖2)。各組隨機(jī)選擇一個質(zhì)粒測序，結(jié)果與所設(shè)計(jì)的siRNA 序列完全一致。同源重組后的pAd-siRARγ同樣可PCR 擴(kuò)增出300 bp的DNA 片段(圖3A)，Pac Ⅰ酶切獲得4 500 bp 的特征性小片段和大于30 kb的大片段(圖3B)。

2.2 HEK293 細(xì)胞中包裝重組腺病毒Ad-siRARγ

pAd-siRARγ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，24 h可觀察到約10% ～20%的RFP 陽性細(xì)胞，10 d左右可見云霧狀擴(kuò)增的RFP 陽性細(xì)胞，最終得到的病毒滴度為2.0 ×108、4.3 ×108和3.7 ×108PFU/mL的重組腺病毒Ad-siRARγ1、2 及3。MOI 分別為40、20 和20時，對小鼠HP 14.5 d細(xì)胞的48 h感染率為60% ～70%(圖4)。

圖1 pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PCR 電泳圖Fig 1 PCR products amplified from recombination shuttle plasmid pSES-siRARγ

圖2 Kpn Ⅰ和EcoR Ⅴ雙酶切pSES-siRARγ 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒Fig 2 Recombination shuttle plasmid pSES-siRARγ plasmids were digested by restriction endonuclease Kpn Ⅰand EcoR Ⅴ

2.3 Ad-siRARγ 能有效感染小鼠HP14.5 細(xì)胞并抑制RARγ 的表達(dá)

Ad-siRARγ1、Ad-siRARγ2 和Ad-siRARγ3 對小鼠HP14.5 細(xì)胞中RARγ 的抑制效率分別為3.7%、68.9%、59.7%，后兩組RARγ 的表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.05)(圖5)。各組蛋白量一致的情況下，Ad-siRARγ1 組的RARγ 表達(dá)與Ad-RFP 對照組相比無明顯差異，而Ad-siRARγ2、Ad-siRARγ 可顯著降低RARγ 的表達(dá)(圖6)。

2.4 Ad-siRARγ 能抑制 ATRA 誘導(dǎo)的小鼠HP14.5 細(xì)胞的分化及功能

圖3 pAd-siRARγ 重組腺病毒質(zhì)粒鑒定Fig 3 Identification of three pairs of pAd-siRARγ adenovirus recombinant

圖4 腺病毒Ad-siRARγ 在HEK293 細(xì)胞中包裝及感染小鼠HP 14.5 d 細(xì)胞Fig 4 Package of Ad-siRARγ in HEK293 cells and infection of mouse HP 14.5 d cells (take Ad-siRARγ1 as example)

圖5 Real-time PCR 檢測不同處理組RARγ 的mRNA 水平表達(dá)Fig 5 The mRNA expression level of RARγ in each treated groups was detected by real-time PCR

圖6 Western blot 檢測不同處理組RARγ 的蛋白水平表達(dá)Fig 6 The protein expression level of RARγ in each treated groups was detected by Western blot

選取能有效抑制RARγ 表達(dá)的Ad-siRARγ2、3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ATRA 能促進(jìn)小鼠HP14.5d 細(xì)胞的成熟分化，ALB-GLuc 的活性顯著高于未誘導(dǎo)組，而Ad-siRARγ2、3 能明顯下調(diào)ATRA 誘導(dǎo)的ALB-GLuc活性(P＜0.05)(圖7)。成熟的肝細(xì)胞具有合成糖原的能力，經(jīng)PAS 染色可在胞質(zhì)中呈現(xiàn)紫紅色顆粒，ATRA 誘導(dǎo)組的PAS 染色陽性細(xì)胞率49.8% ±5.8%遠(yuǎn)高于未處理組5.2% ±2.1%(P＜0.05)，而Ad-siRARγ2、3 抑制RARγ 表達(dá)后，ATRA 誘導(dǎo)的PAS 陽性率分別降至(21.6% ± 4.7%、23.6% ±2.4%(P＜0.05)(圖8)。

圖7 Ad-siRARγ 對ATRA 體外誘導(dǎo)小鼠HP 14.5d細(xì)胞ALB-GLuc 活性的影響Fig 7 The effect of Ad-siRARγ on ATRA induced ALB-GLuc activity of mouse HP14.5 cells

圖8 Ad-siRARγ 抑制ATRA 誘導(dǎo)的小鼠HP14.5d 細(xì)胞糖原合成能力的PAS 染色結(jié)果Fig 8 PAS staining was performed to detect the inhibition of Ad-siRARγ on glycogen storage function of ATRA induced mouse HP14.5 cells (×200)(scale bar=200 μm)(indicated by black arrow)

3 討論

維甲酸(retinoic acid，RA)是維生素A 在體內(nèi)的重要活性代謝產(chǎn)物，ATRA、13-順式維甲酸(13-cis-RA)和9-順式維甲酸(9-cis-RA)，可介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能［8］。RA 可調(diào)控肝代謝相關(guān)基因的表達(dá)，參與胰島素抵抗，用于治療非酒精性脂肪肝［9－10］。RA 與肝臟內(nèi)胚層的發(fā)育密切相關(guān)，在胚胎期可通過wnt 2bb 基因誘導(dǎo)肝臟特化［11］，能使體外培養(yǎng)的去分化成體肝細(xì)胞恢復(fù)正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也能誘導(dǎo)其他來源的干細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化。通過前期實(shí)驗(yàn)證明，小鼠胚胎肝臟前體細(xì)胞在ATRA和9-cis RA 的作用下，肝細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)增高并逐漸出現(xiàn)糖原合成及ICG 攝取的成熟肝細(xì)胞功能，且兩者具有協(xié)同刺激肝細(xì)胞分化作用［4］。

目前認(rèn)為RA 受體有兩類:RAR(retinoic acid receptor)和RXR(retinoic acid X receptor)，均包含由不同基因編碼的α、β 與γ 3 個亞類。ATRA 和9-cis-RA都可以活化RARs，而只有9-cis-RA 能活化RXRs［12］。在前期實(shí)驗(yàn)中，檢測了RA 信號分子在小鼠肝臟發(fā)育過程中的表達(dá)趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RARα 在胚胎及成年期的小鼠肝臟中持續(xù)高表達(dá)，RARβ 在胚胎中期表達(dá)較高，晚期降低，出生后逐漸增高，而RARγ 在胚胎期表達(dá)很低，隨著胎齡增加，逐漸增高，出生后1 個月可達(dá)RARα 的表達(dá)水平［7］，提示RARγ 參與了肝臟的正常發(fā)育和肝細(xì)胞成熟分化。Mukhopadhyay B 還報(bào)道RARγ 可調(diào)控CB(1)R 的表達(dá)調(diào)節(jié)肝臟的脂肪代謝［5］。

本研究希望進(jìn)一步證實(shí)RARγ 對肝細(xì)胞體外成熟分化的影響。通過采用Ad-Easy 腺病毒系統(tǒng)［13］，成功構(gòu)建了3 對特異性針對RARγ 的siRNA腺病毒載體。其中有2 對siRNA 序列對RARγ 有顯著的抑制效果，RARγ 表達(dá)的下調(diào)使得ATRA 對肝細(xì)胞相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用明顯降低，且糖原合成染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示其參與了RA 信號調(diào)控的肝細(xì)胞成熟分化。然而，不同的研究顯示RARγ 基因在肝腫瘤中有致癌的潛能。RARγ 可激活A(yù)kt 和NF-kappaB 信號途徑，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，增加動物體內(nèi)成瘤［14］。因此，可提示RARγ 表達(dá)的平衡可能控制肝細(xì)胞分化成熟度的一個重要因素，過低阻止分化成熟，過高影響細(xì)胞轉(zhuǎn)歸，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Ad-siRARγ 短暫抑制細(xì)胞中RARγ 的表達(dá)提出RARγ 可能是肝細(xì)胞分化中的重要調(diào)控因子，為研究RA 信號在肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞分化及肝腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的思路和研究方向。

［1］Rhinn M，Dollé P．Retinoic acid signalling during development［J］．Development，2012，139:843－858．

［2］Samarut E，Rochette-Egly C．Nuclear retinoic acid receptors:conductors of the retinoic acid symphony during development［J］．Mol Cell Endocrinol，2012，348:348－360．

［3］Chen CF，Goyette P，Lohnes D．RARgamma acts as a tumor suppressor in mouse keratinocytes［J］．Oncogene，2004，23:5350－5359．

［4］Gordy C，Dzhagalov I，He YW．Regulation of CD8(+)T cell functions by RARgamma［J］．Semin Immunol，2009，21:2－7．

［5］Mukhopadhyay B，Liu J，Osei-Hyiaman D，et al．Transcriptional regulation of cannabinoid receptor-1 expression in the liver by retinoic acid acting via retinoic acid receptorgamma［J］．J Biol Chem，2010，285:19002－19011．

［6］Benbrook DM，Kamelle SA，Guruswamy SB，et al．Flexible heteroarotinoids (Flex-Hets)exhibit improved therapeutic ratios as anti-cancer agents over retinoic acid receptor agonists［J］．Invest New Drugs，2005，23:417－428．

［7］Huang J，Bi Y，Zhu GH，et al．Retinoic acid signalling induces the differentiation of mouse fetal liver-derived hepatic progenitor cells［J］．Liver Int，2009，29:1569－1581．

［8］Duester G．Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis［J］．Cell，2008，134:921－31．

［9］Shirakami Y，Lee SA，Clugston RD，et al．Hepatic metabolism of retinoids and disease associations［J］．Biochim Biophys Acta，2012，1821:124－136．

［10］Tsuchiya H，Ikeda Y，Ebata Y，et al．Retinoids ameliorate insulin resistance in a leptin-dependent manner in mice［J］．Hepatology，2012，56:1319－1330．

［11］Negishi T，Nagai Y，Asaoka Y，et al．Retinoic acid signaling positively regulates liver specification by inducing wnt2bb gene expression in medaka［J］．Hepatology，2010，51:1037－1045．

［12］Mark M，Ghyselinck NB，Chambon P．Function of retinoid nuclear receptors:lessons from genetic and pharmacological dissections of the retinoic acid signaling pathway during mouse embryogenesis［J］．Annu Rev Pharmacol Toxicol，2006，46:451－480．

［13］Luo Q，Kang Q，Song WX，et al．Selection and validation of optimal siRNA target sites for RNAi-mediated gene silencing［J］．Gene，2007，395:160－169．

［14］Yan TD，Wu H，Zhang HP，et al．Oncogenic potential of retinoic acid receptor-gamma in hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Res，2010，70:2285－2295．