王桂琦，熊朝暉，杜 萍，王 巖，楊光耀，馬曉靜

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院外科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050011)

斑蝥素為傳統(tǒng)中藥斑蝥的活性成分，臨床上對(duì)多種腫瘤有效，且具有升高白細(xì)胞而無(wú)骨髓抑制特點(diǎn)[1]。斑蝥酸鈉是斑蝥素的半合成藥物，具有抗多種腫瘤作用，并且具有升高白細(xì)胞、增加機(jī)體免疫力等作用[2-3]。與斑蝥素相比，斑蝥酸鈉的毒性、刺激性明顯減小，尤其明顯減低泌尿系統(tǒng)的不良反應(yīng)。但目前文獻(xiàn)對(duì)于其抗癌機(jī)制報(bào)道較少。本研究以人食管癌Eca109細(xì)胞系為對(duì)象，初步探討斑蝥酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制，旨在為臨床治療食管癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥物：RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清,四甲基偶氮唑藍(lán)(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Rnase(美國(guó)Sigma公司),斑蝥酸鈉注射液(貴州神奇制藥有限公司)。

1.1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)：食管癌細(xì)胞株Eca109購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，以含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃含5%的CO2孵箱中進(jìn)行生長(zhǎng)，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶壁70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶來(lái)消化貼壁細(xì)胞，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 細(xì)胞流式儀：美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)熒光激活分選儀(FACS-420型)由河北省腫瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞毒性劑量與時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：Eca109細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度5×108/L，細(xì)胞懸液接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加1mL細(xì)胞懸液與3mL含10%小牛血清的RPMI 1640液，加斑蝥酸鈉，使斑蝥酸鈉終濃度分別為1、4、10、40mg/L，并設(shè)DSMO對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、72h取樣。加入5mg/L MTT 溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入 DMSO 150μL，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)分析儀(490nm波長(zhǎng))測(cè)定每孔光吸收值(OD 值)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。

1.2.2 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡劑量與時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期測(cè)定：斑蝥酸鈉濃度、作用時(shí)間同上。收集斑蝥酸鈉處理后的細(xì)胞，用不含Ca2+Mg2+的PBS洗，離心800r/min，5min，各2次，以注射器針筒取細(xì)胞沉淀并加上TB針頭，推入4℃預(yù)冷的70%酒精使細(xì)胞均勻分散，細(xì)胞固定20h以上。然后將細(xì)胞離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取500μL，加PI 50μL(50mg/L碘化物,0.1%檸檬酸鈉,0 1%氚X-100)在室溫下避光染色30min。樣品過(guò)400目網(wǎng)后用流式細(xì)胞儀測(cè)定，顯示凋亡細(xì)胞散點(diǎn)圖；細(xì)胞凋亡時(shí)在G1期左側(cè)出現(xiàn)近2倍體細(xì)胞群峰。同時(shí)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞G1期、S期及G2+M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化。每個(gè)樣品分析1×106個(gè)細(xì)胞×3平行孔。

2 結(jié) 果

2.1 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞存活的影響：隨著斑蝥酸鈉作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)Eca109細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞不良反應(yīng)亦相應(yīng)增加(P<0.05),隨著藥物濃度的增加Eca109細(xì)胞存活率出現(xiàn)降低(P<0.05)。說(shuō)明斑蝥酸鈉的作用對(duì)時(shí)間、濃度均有依賴(lài)性關(guān)系。見(jiàn)表1。

組別時(shí)間12h24h36h48h72h0mg/L組96.01±2.6594.65±4.3590.41±3.5464.30±4.8553.90±4.051mg/L組90.29±2.5185.59±3.0181.18±4.52 55.69±5.8145.07±6.444mg/L組86.60±1.3079.64±2.7072.80±3.62 48.46±3.0840.22±4.1810mg/L組81.17±2.9471.58±3.1366.54±5.3541.01±6.7035.20±4.4640mg/L組76.23±3.6062.60±4.9054.07±3.2739.36±5.6826.38±6.91

2.2 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡的影響：Eca109細(xì)胞在1、4mg/L斑蝥酸鈉作用后12h即可出現(xiàn)凋亡峰，24h達(dá)高峰；10、 40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用48h才出現(xiàn)明顯的凋亡峰。斑蝥酸鈉在10mg/L濃度時(shí)其誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡的作用較其他濃度呈現(xiàn)明顯時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系。見(jiàn)表2。

2.3 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞周期的影響：Eca109細(xì)胞經(jīng)不同濃度斑蝥酸鈉作用后處于G2+M期細(xì)胞比例均出現(xiàn)增加,呈現(xiàn)G2+M期阻滯現(xiàn)象(P<0.05)。以40mg/L斑蝥酸鈉作用24、48h尤為明顯。見(jiàn)表3。

組別時(shí)間12h24h48h0mg/L組8.36±2.368.25±1.957.12±2.241mg/L組26.21±2.5816.82±2.5114.32±3.304mg/L組35.34±2.3628.32±7.1022.06±2.0610mg/L組44.09±2.9061.28±6.4531.25±4.6540mg/L組51.27±3.2579.30±5.2635.41±3.97

3 討 論

斑蝥酸鈉是一種廣譜抗癌藥，在以往的報(bào)道中單藥或聯(lián)合化療對(duì)食管癌等惡性腫瘤有一定療效[4]，因放療對(duì)于處于G2+M期腫瘤細(xì)胞殺滅作用最強(qiáng)，而斑蝥酸鈉能將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2+M期，故斑蝥酸鈉聯(lián)合放療能起到“增敏”作用，提高放療治療中晚期腫瘤的療效，并降低放療反應(yīng)。斑蝥為芫青科昆蟲(chóng)南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥體，我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤的特性[5]。斑蝥主要藥理成分是斑蝥素，隨著近代藥理學(xué)研究的進(jìn)展，已提取、合成了一系列斑蝥酸鈉、甲基斑蝥胺等衍生物，這些衍生物與斑蝥素相比毒性大大降低，而且抗癌作用更明顯[6]。但是，從目前文獻(xiàn)來(lái)看，斑蝥酸鈉誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的報(bào)道不多[7]。本研究結(jié)果顯示，斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，且存在時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系，無(wú)論是低濃度還是高濃度斑蝥酸鈉均可將Eca109細(xì)胞阻滯于G2+M期。1、4、10、40mg/L 4個(gè)濃度斑蝥酸鈉12h均可檢測(cè)到明顯的G2+M期阻滯；24h時(shí)1、4mg/L 2個(gè)濃度的斑蝥酸鈉G2+M期阻滯已消退，而10、40mg/L斑蝥酸鈉G2+M期阻滯作用達(dá)高峰。上述結(jié)果提示低濃度的斑蝥酸鈉處理的細(xì)胞阻斷G2+M期短暫、不完全；而高濃度的斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞的G2+M期阻斷作用比低濃度的作用完全且持久，并且隨著濃度增高這種阻斷作用越明顯。在G2+M期阻斷作用過(guò)去后，流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到凋亡峰，1、4mg/L斑蝥酸鈉由于其過(guò)早越過(guò)G2+M期，12h即可檢測(cè)到凋亡峰，24h達(dá)高峰；10、40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用后48h才有明顯的凋亡峰，且10mg/L斑蝥酸鈉誘導(dǎo)的凋亡較40mg/L為高。提示低濃度的斑蝥酸鈉可能較高濃度的更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高濃度斑蝥酸鈉更容易導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

斑蝥酸鈉具體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不完全清楚；但目前對(duì)其類(lèi)似物斑蝥素研究較多的是蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)的抑制劑，同時(shí)也是蛋白磷酸酯酶1(protein phosphatase-1,PP1)的抑制劑[8]。如果PP1的功能被抑制，會(huì)使一種重要的周期蛋白R(shí)b不能去磷酸化，細(xì)胞不能完成由M到G1期的正常轉(zhuǎn)換，會(huì)出現(xiàn)M期阻滯等變化。而PP2A活性被抑制，會(huì)促使細(xì)胞越過(guò)G2進(jìn)入M期“檢查點(diǎn)”，使一些復(fù)制未完成或DNA受損的細(xì)胞也進(jìn)入M期，導(dǎo)致異常的有絲分裂，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。由此我們推斷，斑蝥酸鈉誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞凋亡的作用可能與使細(xì)胞發(fā)生M期阻滯有關(guān)。

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