谷 寧，王鵬輝，王振祥，崔鳳琴，李志剛

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū),河南 鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,河南 鄭州 450000)

食管癌是臨床常見的消化道腫瘤,其發(fā)病早期癥狀不明顯,僅表現(xiàn)為吞咽食物哽噎感等進(jìn)行性咽下困難,常被忽視,導(dǎo)致部分患者確診時(shí)已進(jìn)展為中晚期,甚至出現(xiàn)肝、腦等組織器官轉(zhuǎn)移[1-2]。我國食管癌的發(fā)病率約為20.35/10萬,病死率約為15.17/10萬,其病死率位居所有惡性腫瘤第4位[3-4]。目前,由于臨床中食管癌的治療方法及藥物種類有限,食管癌患者的5 a總生存率低于40%[5-6];因此,仍需對食管癌治療藥物進(jìn)行研究開發(fā)。斑蝥酸鈉是從中藥材斑蝥中提取分離得到的單體化合物,其對肝癌等多種腫瘤具有顯著的治療作用[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn),斑蝥酸鈉在食管癌的治療中亦具有顯著療效;鄧亞男[8]研究報(bào)道,斑蝥酸鈉聯(lián)合常規(guī)化學(xué)治療能夠顯著降低食管癌患者腫瘤標(biāo)志物水平及炎癥因子水平;梁楓等[9]研究報(bào)道,斑蝥酸鈉能夠顯著抑制食管癌EC9706細(xì)胞的增殖,促進(jìn)EC9706細(xì)胞的凋亡,并抑制抗凋亡基因在EC9706細(xì)胞中的表達(dá)。但是,目前斑蝥酸鈉對食管癌的治療作用和機(jī)制尚不完全清楚。Wnt3a/β-catenin通路參與多種腫瘤疾病的發(fā)生及進(jìn)展。近年來研究發(fā)現(xiàn),抑制Wnt3a/β-catenin通路蛋白能夠顯著促進(jìn)食管癌TE-1細(xì)胞凋亡[10];大蒜素能夠顯著抑制食管癌模型大鼠腫瘤體積、瘤重及瘤體數(shù)量,其機(jī)制可能與抑制Wnt3a及β-catenin通路有關(guān)[11]。由此可見,調(diào)節(jié)Wnt3a/β-catenin通路蛋白水平可能是治療食管癌的有效途徑?；诖?本研究觀察斑蝥酸鈉對于食管癌EC9706細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及Wnt3a/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響,探討斑蝥酸鈉對食管癌的治療作用和機(jī)制,為斑蝥酸鈉的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

人源食管癌EC9706細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。斑蝥酸鈉購自上海信裕生物科技有限公司(純度>98%),順鉑購自上海吉至生化科技有限公司(純度>99%),達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清、牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司,Wnt3a、β-catenin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司,結(jié)晶紫購自上海寶曼生物科技有限公司,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技(中國)有限公司完成;BXT-TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國BAXIT公司,MK3酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,Mastercycler X50h PCR儀購自德國Eppendorf公司,IX83熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司,COP-T細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海篤特科學(xué)儀器有限公司,Gel Doc EZ凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將EC9706細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清和青霉素(100 000 U·L-1)-鏈霉素(100 mg·L-1)混合液的DMEM,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長至融合度為80%時(shí),去除培養(yǎng)液,加入PBS洗滌2次后,使用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法檢測EC9706細(xì)胞增殖率

將EC9706細(xì)胞密度調(diào)整為2×107L-1,按每孔100 μL將EC9706細(xì)胞混懸液接種于96孔板中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組細(xì)胞中分別加入終質(zhì)量濃度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸鈉繼續(xù)培養(yǎng),順鉑組細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度140 mg·L-1的順鉑繼續(xù)培養(yǎng),空白對照組加入等量新鮮DMEM繼續(xù)培養(yǎng);分別于培養(yǎng)24、48、72 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算各組細(xì)胞增殖率,細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對照組×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測EC9706細(xì)胞遷移率

用記號筆在6孔板后均勻畫橫線,將EC9706細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不含胎牛血清及青-鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組細(xì)胞中分別加入終質(zhì)量濃度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸鈉繼續(xù)培養(yǎng),順鉑組細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度140 mg·L-1的順鉑繼續(xù)培養(yǎng),空白對照組加入等量新鮮DMEM繼續(xù)培養(yǎng);繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,使用移液槍槍頭在培養(yǎng)板底細(xì)胞作一劃痕,測量劃痕距離(記為D1);繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,于顯微鏡下再次測量劃痕距離(記為D2);計(jì)算細(xì)胞遷移率,細(xì)胞遷移率=(D1-D2)/D1×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測EC9706細(xì)胞侵襲率

取EC9706細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1,將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不含胎牛血清及青-鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組細(xì)胞中分別加入終質(zhì)量濃度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸鈉,順鉑組細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度140 mg·L-1的順鉑,空白對照組加入等量新鮮DMEM并繼續(xù)培養(yǎng);繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×107L-1,于Transwell下室加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM,取 100 μL 細(xì)胞加入Transwell小室,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;然后,用棉簽擦去上表面的細(xì)胞,使用結(jié)晶紫染色后,對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞侵襲率。細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/空白對照組細(xì)胞數(shù)×100%,空白對照組細(xì)胞侵襲率記為100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA水平

取EC9706細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1,將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不含胎牛血清及青-鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組細(xì)胞中分別加入終質(zhì)量濃度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸鈉,順鉑組細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度 140 mg·L-1的順鉑,空白對照組加入等量新鮮DMEM并繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用PCR試劑盒對Wnt3a及β-catenin mRNA 水平進(jìn)行定量分析。引物序列:Wnt3a正向引物為5′-GCACCTGAATAGGCAAGTC-3′,反向引物為5′-TCGCACCACCTCAATAAGT-3′;β-catenin正向引物為5′-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3′,反向引物為5′- GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3′;GAPDH正向引物為5′-AAAGTGTGGGCTGAAGCAGT-3′,反向引物為5′-CAGCATAGTGGATGGCCTTT-3′。PCR反應(yīng)體系:定量PCR試劑10 μL,引物各1 μL,cDNA模板2 μL,無RNA酶水6 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.2.6 Western blot法檢測EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相對表達(dá)量

取EC9706細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×108L-1,將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不含胎牛血清及青-鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組細(xì)胞中分別加入終質(zhì)量濃度1.0、2.5、5.0 mg·L-1的斑蝥酸鈉,順鉑組細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度為140 mg·L-1的順鉑,空白對照組加入等量新鮮DMEM并繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解緩沖液,充分裂解后,4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,采用BCA蛋白質(zhì)測定法定量總蛋白;取相當(dāng)于40 μg蛋白的細(xì)胞裂解液進(jìn)樣至聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,并將其電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,使用牛血清白蛋白在室溫下封閉1 h,分別滴加Wnt3a、β-catenin及GAPDH兔單克隆抗體(滴度均為11 000),4 ℃孵育過夜;然后,使用含吐溫-20的PBS清洗3次,每次5 min,使用辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG(滴度為12 000)室溫孵育2 h,再次使用含吐溫-20的PBS清洗3次;取出聚偏氟乙烯膜,滴加超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像;使用ImageJ 1.4.0軟件分析條帶,以GAPDH為內(nèi)參,目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 5組EC9706細(xì)胞增殖率比較

培養(yǎng)24、48、72 h,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞增殖率顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞增殖率顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞增殖率顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞增殖率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 5組EC9706細(xì)胞遷移率比較

空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞遷移率分別為(83.65±3.49)%、(66.93±3.90)%、(40.68±2.43)%、(19.34±4.44)%、(16.87±4.21)%。低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞遷移率顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞遷移率顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞遷移率顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

A:空白對照組;B:低劑量斑蝥酸鈉組;C:中劑量斑蝥酸鈉組;D:高劑量斑蝥酸鈉組;E:順鉑組。

2.3 5組EC9706細(xì)胞侵襲率比較

空白對照組、低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞侵襲率分別為(100.00±0.00)%、(71.09±3.13)%、(52.20±4.50)%、(35.13±5.96)%、(34.88±3.11)%。低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞侵襲率顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞侵襲率顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞侵襲率顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞侵襲率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

A:空白對照組;B:低劑量斑蝥酸鈉組;C:中劑量斑蝥酸鈉組;D:高劑量斑蝥酸鈉組;E:順鉑組。

2.4 5組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較

低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.5 5組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相對表達(dá)量比較

低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白相對表達(dá)量顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相對表達(dá)量顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白相對表達(dá)量顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin 蛋白的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖3和表3。

表2 5組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of relative expression levels of Wnt3a and β-catenin mRNA in EC9706 cells among the five groups

A:空白對照組;B:低劑量斑蝥酸鈉組;C:中劑量斑蝥酸鈉組;

表3 5組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin蛋白相對表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of relative expression levels of Wnt3a and β-catenin protein in EC9706 cells among the five groups

3 討論

食管癌是臨床中常見的消化道腫瘤,我國食管癌患者約占全球食管癌患者的80%以上[12]。食管癌的發(fā)生與亞硝胺類物質(zhì)攝入、飲食習(xí)慣及生物性因素等密切相關(guān)。食管癌在早期臨床表現(xiàn)為吞咽困難等癥狀,癥狀不明顯,病情進(jìn)展緩慢,因此,患者確診時(shí)可能已進(jìn)展為中晚期。目前,對于食管癌的主要治療方式有手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)治療。然而,仍有部分經(jīng)上述治療手段治療的患者預(yù)后差,且存在易復(fù)發(fā)、患者生活質(zhì)量降低等缺點(diǎn);另外,放射治療及化學(xué)治療后易導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨髓抑制、放射性食管炎等多種不良反應(yīng)[13]。順鉑是目前臨床中常用的治療食管癌的藥物,通過破壞癌細(xì)胞DNA復(fù)制發(fā)揮抗癌體用[14],但在臨床應(yīng)用中,順鉑及其聯(lián)合其他化學(xué)治療藥物的治療方案均表現(xiàn)出有效率低且不良反應(yīng)發(fā)生率高的特點(diǎn)。有研究表明,采用順鉑聯(lián)合吉西他濱化學(xué)治療的食管癌患者有效率約為66%,治療后2 a患者生存率低于40%[15]。因此,食管癌治療藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前工作重點(diǎn)。

斑蝥酸鈉是從傳統(tǒng)中藥材斑蝥中提取分離并進(jìn)一步加工合成后得到的化合物,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[16-17],其對于肺癌、乳腺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤疾病均具有顯著的藥理作用[18-20]。近年來研究發(fā)現(xiàn),斑蝥酸鈉對于食管癌也具有顯著的治療作用。劉德仁等[21]臨床研究表明,斑蝥酸鈉能夠顯著改善晚期食管癌患者惡心嘔吐、四肢無力等癥狀,且與常規(guī)化學(xué)治療方案比較,斑蝥酸鈉能夠明顯提高患者腫瘤緩解率;蔣淑年等[22]研究發(fā)現(xiàn),斑蝥酸鈉能夠顯著提高患者放射治療的有效率,且不增加毒副作用;賈金明等[23]研究發(fā)現(xiàn),斑蝥酸鈉能夠提高晚期食管癌患者靜脈化學(xué)治療的效果,并減少不良反應(yīng)的發(fā)生,提高患者生存質(zhì)量。由此可見,斑蝥酸鈉對于食管癌的治療具有較大潛力。然而,目前斑蝥酸鈉對于食管癌的作用機(jī)制尚不明了。本研究結(jié)果顯示,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞的增殖率、遷移率及侵襲率顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞的增殖率、遷移率及侵襲率顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞的增殖率、遷移率及侵襲率顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組;而高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞的增殖率、遷移率及侵襲率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示,斑蝥酸鈉能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力,并能夠通過抑制其侵襲和遷移能力抑制其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,且呈一定的劑量依賴性;高劑量斑蝥酸鈉對EC9706細(xì)胞增殖能力及侵襲、遷移能力等方面的影響與順鉑相似效果。

Wnt3a及β-catenin通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要信號通路。彭慧等[24]研究發(fā)現(xiàn),Wnt3a及β-catenin通路異常激活與食管癌TE1、Eca109及EC9706細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān),而抑制Wnt3a及β-catenin通路相關(guān)蛋白水平能夠顯著抑制TE1、Eca109及EC9706細(xì)胞增殖和遷移能力;王璋等[25]研究發(fā)現(xiàn),通過白藜蘆醇抑制Wnt3a及β-catenin蛋白水平能夠顯著抑制KYSE150、TE-1及Eca-109細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞存活率。由此推測,Wnt3a/β-catenin通路可能是食管癌發(fā)生及進(jìn)展過程中的重要通路,抑制Wnt3a及β-catenin蛋白的表達(dá)可能是抑制食管癌進(jìn)展的重要手段,其可能是食管癌治療中的重要潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組、高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相對表達(dá)量顯著低于空白對照組,低劑量斑蝥酸鈉組、中劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相對表達(dá)量顯著高于高劑量斑蝥酸鈉組和順鉑組,低劑量斑蝥酸鈉組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相對表達(dá)量顯著高于中劑量斑蝥酸鈉組,高劑量斑蝥酸鈉組與順鉑組EC9706細(xì)胞中Wnt3a及β-catenin mRNA和蛋白的相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明,斑蝥酸鈉能夠呈劑量依賴性地顯著抑制食管癌EC9706細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin的表達(dá),進(jìn)而抑制Wnt3a、β-catenin的異常激活,導(dǎo)致Wnt3a/β-catenin通路障礙,從而抑制EC9706細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

4 結(jié)論

斑蝥酸鈉能夠抑制食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt3a/β-catenin通路有關(guān)。但是,本研究未探討斑蝥酸鈉對EC9706細(xì)胞Wnt3a/β-catenin通路上下游其他相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,有待進(jìn)一步研究。