周春華，張志清* ，何文娟，李敬瑄，吳亞敏

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室，河北 石家莊 050017)

左乙拉西坦(levetiracetam)是吡拉西坦衍生物中的左旋乙基吡拉西坦，其化學名稱為(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，分子式為C18H14N2O2[1-2]。左乙拉西坦是一種新型的抗癲癇藥，其結(jié)構(gòu)和抗癲癇的機制與其他藥物不同，主要是選擇性地抑制癲癇樣突發(fā)放電的超同步性和癲癇發(fā)作的傳播而發(fā)揮作用，2007年引入中國，用于治療癲癇的部分發(fā)作、原發(fā)性或繼發(fā)性全身發(fā)作[3-5]。左乙拉西坦口服幾乎可以完全吸收，進食可減慢其吸收速度，但不影響其吸收程度[6]。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑：左乙拉西坦對照品(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，純度>99%，批號404809001)，替硝唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，純度>99%，批號100336-200402)，磷酸(分析純，石家莊化工廠，批號19981116)，乙腈(色譜純天津市康科德科技有限公司，批號101203)，乙酸乙酯(分析純，天津市北辰馬華躍化學試劑廠，批號20050718)，蒸餾水(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院自制)。

1.2 儀器：高效液相色譜儀，Waters 515泵，486色譜檢測器，操作平臺Empower Application；電子天平(FA2104，上海良平精密儀器廠)；冰箱(日本三洋，型號MDF-U2086S)；離心機(北京醫(yī)用離心機廠，LD5-10)；渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠，XW-80A)；數(shù)控恒溫水浴(北京康林科技有限責任公司，氮吹儀專用，KL512J)；抽濾泵(天津市協(xié)同儀器有限公司)；超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 色譜條件：色譜柱，Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)；檢測波長210nm；柱溫35℃；進樣量20μL[7]；流速1.0mL/min；內(nèi)標為替硝唑。

2 方法與結(jié)果

2.1 模擬生物樣品處理方法：取血清180μL于10mL塑料離心管中，加左乙拉西坦(系列濃度)20μL和內(nèi)標(200mg/L)50μL，混勻，加乙酸乙酯3mL，渦旋，離心，取2.5mL上清液于5mL玻璃離心管中，50℃水浴，氮氣流吹干，100μL甲醇復溶，進樣。

2.2 溶液的配制：儲備液的制備，精密稱取左乙拉西坦50mg，溶于50mL量瓶中，用甲醇溶解定容，得1g/L的左乙拉西坦溶液作為母液。

標準溶液的制備，取儲備液適量于25mL的量瓶中，分別用甲醇稀釋成10、25、50、200、400、800mg/L的標準溶液；再取800mg/L的標準溶液適量于25mL的量瓶中，甲醇稀釋成100mg/L的標準溶液。

內(nèi)標溶液的制備，精密稱取替硝唑?qū)φ掌芳s20mg置100mL量瓶中，甲醇稀釋定容，得200mg/L的內(nèi)標溶液。

2.3 專屬性考察：在選定的色譜條件下，內(nèi)標與藥物完全分離，藥物保留時間為4.3min，內(nèi)標保留時間為8.4min，出峰時間均在10min之內(nèi)，且血清中的內(nèi)源性物質(zhì)對其無干擾，見圖1。

2.4 標準曲線的制備：取血清常溫融化，精密吸取180μL于10mL塑料離心管中,加系列濃度的左乙拉西坦溶液20μL，加內(nèi)標50μL，配成血清中左乙拉西坦?jié)舛纫来螢?、2.5、5、10、20、40、80mg/L的標準溶液，依次加入提取劑(乙酸乙酯)3mL，渦旋混合2min，4 000r/min離心5min，取上清液2.5mL于5mL

玻璃離心管中，50℃水浴，氮氣流吹干，100μL甲醇復溶，進樣。以藥物和內(nèi)標的峰面積比值對藥物濃度進行線性回歸得線性回歸方程Y=0.096 4X+0.017 2(r=0.999 1)，線性范圍1～80mg/L。

圖1 高效液相色譜圖

A.空白血清；B.血清模擬樣品；C.給藥后血清樣品；1.左乙拉西坦；2.內(nèi)標

Figure 1 HPLC chromatograms

A.Blank serum;B.Blank serum with levetiracetam and tinidazole;C.Serum sample;1.Levetiracetam;2.Tinidazole

2.5 回收率

2.5.1 提取回收率：配制左乙拉西坦血清濃度分別為2.5、10、40mg/L的模擬血清生物樣品，并按“2.1”項下處理方法處理，進樣，測定藥物峰面積S血藥。另取濃度分別為2.5、10、40mg/L的標準溶液，吹干，100μL甲醇復溶后直接進樣測定藥物峰面積S純藥。取180μL血清加100mg/L的內(nèi)標溶液50μL，其余按血清生物樣品處理方法處理，測定峰面積S血清內(nèi)標。另取濃度為100mg/L的內(nèi)標溶液，吹干，100μL甲醇復溶后進樣測定峰面積S純內(nèi)標。左乙拉西坦與內(nèi)標的提取回收率。見表1。

2.5.2 方法回收率：配制左乙拉西坦血清濃度分別為2.5、10、40mg/L的血清模擬生物樣品各5份，并按“2.1”項下處理方法處理，測得峰面積比值，并根據(jù)標準曲線得到濃度，利用該濃度與加入濃度的比值計算方法回收率。見表1。

2.6 精密度：配制高、中、低濃度分別為2.5、10、40mg/L的模擬血清樣品，均按“2.1”處理方法處理，日內(nèi)連續(xù)測定高、中、低各5組的峰面積，得到峰面積比值，根據(jù)標準曲線計算日內(nèi)精密度；日間連續(xù)5d測定高、中、低3個濃度的模擬生物樣品，根據(jù)標準曲線計算日間精密度。見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery and precision test (n=5，%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.7 穩(wěn)定性考察：取180μL血清于10mL塑料離心管中，加100mg/L的左乙拉西坦溶液20μL，分別考察-40℃冰箱放置5d穩(wěn)定性、反復凍融3次穩(wěn)定性和處理樣品室溫放置4h穩(wěn)定性。見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability test (n=5,%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.8 臨床應(yīng)用：本法可用于臨床患者血清中藥物濃度的測定。

3 討 論

內(nèi)標選擇曾考慮過以拉莫三嗪、奧卡西平，并依次在254、210、220、240nm波長處測定其出峰時間和峰面積，但都由于最大吸收波長與藥物最大吸收波長不接近而導致在以上波長條件下吸收過小，并最終選定替硝唑為內(nèi)標，選用該內(nèi)標具有雜質(zhì)干擾少、保留時間適宜等優(yōu)點。

分離提取時先采用乙酸乙酯和二氯甲烷2種溶劑分別作為提取劑，雖然二氯甲烷[8]提取不易出現(xiàn)乳化，但通過比較兩者提取后雜質(zhì)峰的干擾程度，最終采用乙酸乙酯，采用乙酸乙酯提取使提取率較高而且穩(wěn)定，各濃度提取率的平均相對偏差均小于10%。

根據(jù)查閱的文獻[9-10]初步確定選用0.4%磷酸溶液和乙腈的混合溶液為流動相并最終確定乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)作為流動相，該流動相可使血清中的雜質(zhì)，藥物和內(nèi)標的到很好的分離。

本實驗方法中對左乙拉西坦血清樣品2.5、10、40mg/L 3個濃度做了日內(nèi)、日間精密度的測定，分別算出平均值、標準差。由數(shù)據(jù)可知,左乙拉西坦日內(nèi)、日間精密度RSD均在規(guī)定范圍內(nèi)，因此本實驗方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，能夠用于血藥濃度測定。

試驗中我們還發(fā)現(xiàn)含左乙拉西坦的血清在-40℃低溫保存和反復凍融時，血藥濃度基本不變。從而保證實驗方法的可行性，為今后的研究工作提供了方法和依據(jù)。

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