田貴金，唐瑞峰，孫 超，苑建磊，齊 帥，李智峰

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省邯鄲市第一醫(yī)院普外三科，河北 邯鄲 056002)

原發(fā)性肝癌惡性度高，預后差是因為腫瘤具有強大的生長和轉(zhuǎn)移能力，而癌細胞的浸潤和遠處轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)密切相關(guān)。其通過誘導腫瘤周圍血管新生，促進癌細胞血行轉(zhuǎn)移。VEGF-B的表達受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，其中細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)2、6可以通過影響細胞活動力、腫瘤細胞的增殖、腫瘤特異性抗原的表達從而影響腫瘤的進展，也可以通過調(diào)節(jié)VEGF-B的表達來影響腫瘤的生物學特性。本研究分析IL-2及IL-6對人肝癌細胞表達VEGF- B的調(diào)節(jié)，旨在為肝癌的治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)、刺激及總RNA的提?。涸?7℃、5%CO2的飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中應用RPMI 1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721及BEL-7402。細胞呈穩(wěn)定對數(shù)生長后，更換濃度為0.1%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，以消除血清對細胞增殖的影響。然后分別應用含有0.1、1、10、100、200μg/L的IL-2或IL-6的0.1%胎牛血清的培養(yǎng)基作為實驗組，分別培養(yǎng)3、6、12、24h，對照組中加入等劑量的磷酸鈉鹽緩沖液培養(yǎng)，定時收取細胞后以Trizol一步法提取刺激前后總RNA。

1.2 RT-PCR：取總RNA 2μL，加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶及逆轉(zhuǎn)錄反應物，42℃、反應60min；取所得單鏈cDNA 2μL，加入VEGF-B正義引物2.5μ、反義引物2.5μL、PCR反應物13μL，使總反應體系為20μL，94℃、3min預變性，95℃、45s變性，57℃、45s退火，72℃、1min延伸，共擴增35個循環(huán)后72℃、5min再次延伸。同法，取所得cDNA 2μL，加入GAPDH正義引物2.5μL、反義引物2.5μL、PCR反應物13μL，使總反應體系為20μL，預變性條件95℃、3min，變性條件94℃、30s，57℃、30s退火，72℃、 30s延伸，共擴增35個循環(huán)后72℃再次延伸5min。擴增循環(huán)數(shù)由PCR擴增動力學實驗決定。各PCR總產(chǎn)物在普通瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳，運用溴化乙啶染色，所得DNA電泳條帶和光量子強度以凝膠掃描儀進行檢測分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，并將VEGF-B/GAPDH比值作為相對定量值對VEGF-B產(chǎn)物相對定量。VEGF-B正義引物，5′TGTCCCTGGAAGAACACAGCC3′，反義引物，5′GCCATGTGTCACCTTCGCA 3′，它對應生成1個336個堿基的基因片段。GAPDH正義引物，5′GGGAAACTGTGGCGTGAT3′，反義引物，5′GTGGTCGTTGAGGGCAAT3′，它對應生成1個342個堿基的基因片段。

2 結(jié) 果

在0.1～200μg/L范圍內(nèi)，隨濃度的增加，IL-2抑制肝癌細胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表達的作用逐步增強，但與作用時間無明顯關(guān)系(圖1)。

圖1 IL-2對肝癌細胞SMMC-7721表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 1 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-2

隨濃度的增加，IL-2抑制肝癌細胞株BEL-7402 VEGF-B mRNA表達的作用逐步增強，3h 0.1μg/L與1μg/L實驗組之間VEGF-B mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.488)，12h 0.1μg/L與1μg/L實驗組之間VEGF-B mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.074)；但與作用時間無明顯關(guān)系(圖2)。

圖2 IL-2對肝癌細胞BEL-7402表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 2 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-2

隨濃度的增加，IL-6促進肝癌細胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表達的作用逐漸減弱，但與作用時間無明顯關(guān)系(圖3)。

圖3 IL-6對肝癌細胞SMMC-7721表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 3 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-6

IL-6對肝癌細胞株BEL-7402 表達VEGF-B mRNA無明顯影響(圖4)。

圖4 IL-6對肝癌細胞BEL-7402表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 4 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-6

3 討 論

原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是我國病死率很高的惡性腫瘤，早期診斷率低，病情進展快，預后差[1]。早期血行轉(zhuǎn)移是導致肝癌預后差的主要原因之一，而腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有賴于血管新生，血管內(nèi)皮生長因子家族(vascular endothelial growth factor family,VEGFs)是促進血管新生的關(guān)鍵因子之一，VEGFs包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(placenta growth factor，PIGF)，我們的前期研究顯示VEGF-B及其受體Flt-1在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織，且二者在肝癌中的表達呈顯著正相關(guān)，二者相互作用促進肝癌血管生成，進而促進肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。

在惡性腫瘤的進展中某些細胞因子起重要作用[3-4]。這些細胞因子是癌細胞與基質(zhì)細胞間相互作用的主要介質(zhì)，而癌細胞與基質(zhì)細胞間相互作用是癌細胞浸潤周圍組織、形成淋巴和遠處臟器轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。IL-1和IL-6可促進VEGF的表達，促進新生血管的形成[5]；IL-1α和IL-6可刺激胰腺癌細胞產(chǎn)生VEGF-A和VEGF-C，是胰腺癌細胞合成和分泌VEGF-A、VEGF-C的調(diào)節(jié)因子[6]；IL-2通過抑制胰腺癌細胞產(chǎn)生VEGF-D而抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移[7]；Salven等[8]報道了IL-1α通過誘導炎癥細胞合成和分泌VEGF-A促進血管新生；Huang等[9]證實了IL-6刺激胃癌VEGF-A的產(chǎn)生并使癌組織中新生血管增加。

IL-2是一種重要細胞因子，IL-2不僅能通過激活免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，同時能抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[10-11]。本研究表明，IL-2對2種肝癌細胞株SMMC-7721及BEL-7402產(chǎn)生VEGF-B mRNA均有抑制作用。提示IL-2通過抑制肝癌細胞產(chǎn)生VEGF-B而抑制肝癌的血行轉(zhuǎn)移。

IL-6在免疫應答及炎癥反應中起重要作用，它可以通過細胞因子網(wǎng)絡影響宿主環(huán)境進而作用于腫瘤細胞，對腫瘤細胞有抑制和促進的雙重作用。多種疾病可能都與IL-6基因調(diào)節(jié)異常有關(guān)[12]。當IL-6及其受體平衡失調(diào)時，會影響機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而導致免疫功能紊亂，誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示IL-6刺激肝癌細胞株SMMC-7721產(chǎn)生VEGF- B明顯增加，從而可能使肝癌細胞更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，是肝癌難以早期發(fā)現(xiàn)和預后較差的原因之一。肝炎后肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌，癌細胞周圍的微環(huán)境中因炎性反應致IL-6呈持續(xù)高水平表達，刺激癌細胞產(chǎn)生VEGF-B增加，使癌細胞更易發(fā)生肝內(nèi)等血行轉(zhuǎn)移，這可能是肝炎后肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的肝癌其預后較無肝炎肝硬化背景的肝癌的預后差的原因之一，也可能是臨床上抗病毒加抗癌“雙管齊下”較單純抗癌治療效果更好的原因之一。但IL-6對肝癌細胞的作用可能是一把“雙刃劍”，其作用隨劑量、機體微環(huán)境的變化而不同，仍需進一步研究。

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